[发明专利]一种植物多基因表达载体组合及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物多基因表达载体组合及其应用。

背景技术

在过去的几十年里，科学家发展了大量在植物细胞中适于克隆，转移和表达外源基因的载体。虽然这些载体在植物学研究和生物技术领域被证明具有可操作性，但是这些载体的基本设计都存在很大的限制性，并且很少允许克隆和转移多于一个目的基因(除了筛选基因)。由于对剖析复杂的代谢途径研究的逐渐关注，以及发掘多基因性状对植物生物工程的潜力，致使需要一些新的方法和工具来同时转化多个基因。

作为植物遗传工程的主要方法，农杆菌载体在过去的几十年里随着研究目的的不同进行了不断的改进和修饰。纵观各种农杆菌双元载体，均具有一个基本结构：T-DNA和载体骨架。T-DNA由边界序列(LB，RB)所限定，包含多克隆位点(MCS)，植物选择标记基因，报告基因和感兴趣的目的基因。长度一般在12～24kb，是在农杆菌侵染细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物基因组中的一段DNA序列。载体骨架包括质粒复制功能单位(ColE1)，细菌的选择标记基因(Kan和Amp)，和一些对质粒移动具有功能的附属单位(OriT和bom)(Toshiyuki Komori et al，2007，Plant Physiology，December 2007，Vol.145，pp.1155-1160)。由农杆菌介导的T-DNA的转移和整合是细菌和植物细胞相互作用发生生物学效应的过程，兼具原核生物中的细菌结合转移及真核细胞加工修饰的特点。

最早构建的双元载体是pBin19(Bevan M(1984)Binary Agrobacterium vectors for plant transformation.Nucleic Acids Res 12：8711-8721)，随后通过将一个标记基因引入到其中产生了pBI121(Jefferson RA(1987)Assaying chimeric genes in plants：the GUS gene fusion system.Plant Mol Biol Rep 5：387-405)。随着时间的推移，还产生了pPZP载体(Hajdukiewicz P，Svab Z，Maliga P(1994)The small，versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation.Plant Mol Biol 25：989-994)及其改进型pCAMBIA载体系列，也就是现在常用的载体，它们普遍具有广谱的抗菌筛选范围，在大肠杆菌中保持高拷贝数，对宿主菌株有更高的兼容性，很高的转化效率等特征。

20世纪80年代以来，以转基因技术为代表的植物基因工程技术的广泛应用为植物的遗传改良开拓了广阔的前景。传统的转基因植物绝大多数是通过单个目的基因的遗传转化来定向改良单一性状来获得的。长期以来，培育具有多种优良品质，如高产、优质、高抗、多抗、营养均衡、具备其他生产上有用的特性的作物品种一直是科学家进行植物遗传改良的终极目标。而在这个目标的实现上，又有两个层次：

首先是如何通过表达一条代谢途径上的几个基因，来增强某一单一优质性状的表达.因为在自然界中，生物体的生长发育是由一条条代谢途径组成的，而每条代谢途径是由一个个基因组成，它们按序表达，依次衔接，构成生物自身的代谢网络.而具体到某一性状，可以定向到某一段代谢途径，进而几个关键酶基因，通过表达或抑制关键酶基因来得到我们需要的性状.

其次是如何同时表达某些特定性状的关键酶基因得到聚合有高产，高质等多优良性状的植株，即所谓的植物多目标分子聚合育种。例如可以通过将植物耐盐代谢途径，抗旱代谢途径，抗病代谢途径中的关键基因克隆，整合进入一个新的植株中，实现植物品质的多目标整体提高。

为此，多基因组装与转化技术便应运而生，以便将多个目的基因导入到植物基因组中并在植物中进行表达。多基因转化的载体构建策略，大概可以分为以下几个方面

1.基于单基因单载体的转化

就是每个载体携带有一个外源基因(筛选基因除外)，为了达到将多个基因整合进入生物体的目的，这就需要许多个载体利用不同的方法进行操作。例如：有性杂交聚合法，重复转化法，共转化法，功能结构域融合法等。

2.基于多基因单载体的转化