[发明专利]高质量提取酸性土壤基因组DNA的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及针对酸性土壤样品进行一定的处理以提取得到高质量土壤微生物基因组DNA。

背景技术：

不依赖培养的分子生态学技术逐渐成为解析和认识土壤微生物的多样性以及原位条件下的生理特征的有力手段。目前分子生态学已经涉足多个研究领域，对原位条件下研究环境微生物群落多样性和生态生理功能提供了大量的有价值的信息。分子生态学的基础依赖于高质量的DNA模板。目前提取土壤微生物基因组DNA的方法很多，主要包括商品化的试剂盒方法(例如等)以及文献中的方法(例如周氏方法等)等。酸性土壤中含有腐殖酸物质、重金属等，这些物质的存在会强烈抑制PCR扩增，影响内切酶消化等、以及一些下游分析相应的分子生物学操作。针对酸性土壤样品，上述提到的提取土壤基因组DNA的方法存在一些不足，要么提到的土壤基因组DNA的量不大，要么提取的土壤基因组DNA中含有大量抑制PCR扩增等的重金属离子等污染物，使得PCR扩增难以成功。这些不利因素严重影响到对土壤微生物的生态多样性、种群结构分布等的正确认识。因而有必要改进现有的土壤微生物基因组的提取方法，以解决在提取酸性土壤时出现的一些问题，得到适用于下游分析的高质量土壤微生物基因组DNA。

发明内容：

本发明旨在通过预处理技术，预先去除酸性土壤中的腐殖酸物质、重金属等干扰物，提取并获得高质量的土壤微生物基因组DNA，为更好的开展土壤微生物分子生态学研究提供方便。

本发明所述的高质量提取酸性土壤基因组DNA的方法如下：

(1)样品的处理：待提取基因组DNA的酸性土壤样品与1～2倍体积的0.1～0.3％的无菌焦磷酸钠溶液混匀，室温温育10～30min，间歇摇匀。

(2)样品的收集：处理过的样品，8000～12000×g离心10～20min，收集沉淀物。

(3)收集的土壤沉淀物作为提取基因组DNA的材料。提取的方法选用任意一种，包括：商品化的试剂盒方法、周氏方法以及由周氏方法衍生的提取方法。

本发明依据物理化学以原理利用焦磷酸钠处理样品以除去酸性土壤中的腐殖酸，置换土壤中含有的重金属离子，处理后再提取土壤基因组DNA。本发明的酸性土壤的处理技术简单可行，成本低廉，提取的基因组DNA质量高，可以直接应用于下游分析。

附图说明：

图1提取获得的土壤基因组DNA琼脂糖凝胶电泳照片

其中1，土壤样品经过焦磷酸钠处理；2，土壤样品不经处理。Marker是分子量标记，购自宝生物公司，数字表示DNA的大小，单位是bp。

具体实施方式：

以下将将结合具体实施例对本发明作进一步的说明，目的在于帮助读者更好的理解本发明的精神实质，但不作为对本发明实施范围的限定。

实施例：

选取中国科学院亚热带农业生态研究所桃源站为研究地点，采集5～15cm的稻田土壤样品为研究对象，土壤的理化等性质测定结果(pH为4.96，总有机碳含量2.37％)。称取5g土壤样品，置于50ml离心管中，加入5ml焦磷酸钠溶液(0.1％)，颠倒数次混匀后，置于室温条件下20min，间隔10min轻柔颠倒混匀。然后在10000×g室温条件下离心10min，称取0.5g沉淀物采用试剂盒抽提土壤基因组DNA，提取方法参照生产商随同试剂盒提供的方案。对照实验，直接称取0.5g未经任何处理的土壤样品，采用试剂盒抽提土壤基因组DNA。图1说明两种方法提取的土壤微生物基因组DNA大约在23kb的位置，但焦磷酸钠处理过的土壤样品，提取得到的DNA相对更完整。焦磷酸钠处理后DNA的产量(54.2μg DNA/g土)高于未经过处理的土壤样品(34.2μg DNA/g土)。

选择细菌16S rDNAV3区的通用引物357f-GC(5′-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGCGGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3′)和518r(5′-ATT ACCGCG GCT GCT GG-3′)作为PCR扩增的引物。PCR扩增体系选用ExTaq体系(宝生物公司)。扩增条件为95℃预变性5min；95℃变性30sec，55℃退火45sec，72℃延伸45sec，30个循环；72℃延伸10min；4℃保持。采用伯乐公司的Dcode系统进行变性梯度凝胶电泳，变性梯度为40～60％，60v电压，电泳时间17h。借助Quantity one软件分析DGGE凝胶图谱，并计算香农指数。