[发明专利]斑点野生稻的PCR鉴定引物及鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术，具体地说涉及对斑点野生稻生物资 源进行检测用引物及PCR检测方法。

背景技术

野生稻由于长期经受各种灾害和不良环境的自然选择，蕴含大 量的有利基因如抗病、抗虫、抗逆及雄性不育等栽培稻不具有或已 消失的特异基因，是水稻遗传改良的重要基因源。伴随近十几年来 工业的发展，城市化建设的进程，以及环境污染、人口增长等人为 因素对野生稻的生存带来了严重的危害，加上物种流失的加剧，主 要的野生稻分布面积正在迅速减少，所以保护和鉴定野生稻显得尤 为重要。虽然稻属多倍体起源和系统发育关系的基本框架已经形成， 但是其物种的分类和鉴定仍非常困难，特别是把形态、地域分布或 细胞型考虑在内时就更为严重，在非洲广泛分布的斑点野生稻O. punctata鉴定和利用面临的困难就是很典型的例子。

水稻的分类鉴定和种间亲缘关系的研究多集中于形态学和细胞 遗传学的分析研究。近几年来借助于分子生物学手段，如AFLP、 RFLP、SSR、RAPD、FISH、GISH等技术，对稻属基因组间的亲 缘关系进行了较广泛的研究。但是在口岸物种资源的查验中，这些 分子手段都面临着技术含量高、操作复杂、耗时、成本高、不能通 用和难于标准化等问题，很难满足实际工作的需要。寻找合适的基 因、DNA片段进行比较分析，利用分子标记简单、准确、快捷和不 受植物生长周期限制等优势发展合适的分子鉴定体系是比较科学的 策略。W.John Kress等认为色素体psbA-trnH基因能够很好的区分 陆生植物，特别是开花植物。通过比较全部的烟草和龙葵属植物， 以及七个近缘的植物属和从一个植物区系的五十个植物属中抽样的 被子植物，提出该基因在区别鉴定植物物种上有巨大的潜力。

目前国内外对于O.punctata的识别仅限于形态上，未见分子检 测方法的研究。

本发明应用PCR方法对斑点野生稻的分子检测方法进行研究， 通过psbA-trnH序列设计特异引物，建立了对斑点野生稻稳定、高 效的鉴定方法、成本低，可根据对扩增产物的普通琼脂糖电泳判定 是否有斑点野生稻核酸存在。

发明内容

本发明目的在于提供用于斑点野生稻PCR检测的引物及方法。

本发明通过分析斑点野生稻O.punctata与稻属及其近缘种等禾 本科植物叶绿体psbA-trnH基因序列的基础上，设计特异引物，能 够快速、准确地对O.punctata进行定性检测。

本发明提供的检测引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和2所示。

以样品总DNA为模板，上述的引物进行PCR扩增，根据PCR 扩增产物判定样品是否为斑点野生稻。即检测PCR产物中是否存在 118bp的特异性扩增。具体地说，可以利用琼脂糖凝胶电泳进行检 测，根据是否存在118bp的特异性条带，来判断样品是否为阳性。

PCR 25μL反应体系：样品DNA 1μL(10-50ng)，10×PCR buffer (Mg²⁺ free)2.5μL，25mM MgCL2 2μL，10mM dNTPs 2μL，10μM Primers 1μL/1μL，5U/μL Taq DNA polymerase 0.1μL，ddH₂O 15.4μL。

反应条件：预变性94℃4min，再经94℃变性1min，62℃退火 1min，72℃延伸1.5min，30循环，最后72℃延伸7min。

可以将本发明引物以及相关试剂组装成试剂盒，以方便使用。

本发明建立了适合口岸应用的简便的检测方法，即直接从进、 出境的禾本科类材料上检测斑点野生稻，操作快捷、结果准确，避 免了用传统的形态分类学和细胞学方法所产生的耗费时间和易疏漏 的缺陷，顺应了当今口岸检测工作的特点。

附图说明

图1是PCR法对斑点野生稻特异性检测实验；