[发明专利]副猪嗜血杆菌aroA基因自杀载体及构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及动物疫病防控领域，特别是涉及一种副猪嗜血杆菌aroA基因自杀载体及构建方法。

背景技术

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，Hps)是巴氏杆菌科成员，革兰氏阴性小杆菌，主要引起猪的多发性浆膜炎、关节炎；出现以发热、咳嗽和呼吸障碍等为特征的呼吸道疾病症候群。可以并发或继发于蓝耳病、伪狂犬病、细小病毒病、圆环病毒病、猪瘟等疫病，使疫情复杂化，经济损失加重。Glasser(1910)首次报道了该菌与猪的纤维素性浆膜炎和多发性关节之间的联系，故该病也称Glasser’s病，Kilian1976证明了该菌生长时不需要X因子(血红素和其它卟啉类物质)，将该菌命名为副猪嗜血杆菌(Bouchet B，Vanier G，Jacques M，et al.Studies on the interactions of Haemophilus parasuis with porcine epithelial tracheal cells：Limitedrole of LOS in apoptosis and pro-inflammatory cytokine release[J].Microbial Pathogenesis.2009，46(2)：108-113)。

芳香族氨基酸在细菌中只有一条通过分枝酸的合成途径，打断这一途径中的任何一个关键基因，如aroA，axoD，aroC等，都能阻断细菌芳香族氨基酸的合成，而芳香族氨基酸在哺乳动物细胞内不是一种代谢产物，含量甚微，故细菌从宿主体内获得这些化合物的可能性极小，因此这些基因发生突变的细菌在宿主体内只能有限生长繁殖从而导致减毒效应(刘英杰，芮贤良，徐永强，等.志贺氏菌芳香族氨基酸缺陷减毒株的构建[J].武警医学.1999(02)：68-70.)。

自杀质粒是指那些在某些特定的细菌中自主复制而在其它细菌中不能自主复制的质粒，它的复制需要一种特殊蛋白，大多数细菌不产生这种蛋白质，因此，当进入寄主细胞时，要么不能复制，被消除，要么被整合到染色体上和染色体一起复制，利用自杀质粒的这一特点，将基因工程技术构建的基因突变DNA片段，克隆入自杀质粒，利用突变基因两端的同源片段与基因组发生同源交换重组构建精确的基因缺失株(徐建国主编.分子医学细菌学[M].北京：科学出版社，2000：296)，基因缺失株可作为动物疫病防治的疫苗。

徐引弟等构建了重组自杀性质粒，获得了猪霍乱沙门氏菌突变株(徐引弟，郭爱珍，陈焕春.猪霍乱沙门氏菌C500株crp～-/gfp～+缺失株的构建及鉴定[J].农业生物技术学报.2008(02)：196-201.)。罗晓松等通过自杀质粒构建了嗜水气单胞菌aopB-/aopD-/aroA-缺失株(罗晓松，尚书，侯化鹏，等.鱼源嗜水气单胞菌aopB～-/aoopD～-/aroA～-缺失株的构建及鉴定[J].农业生物技术学报.2009(01)：440-442.)。胡奕等利用自杀性载体和同源重组的原理构建了O45的ler基因缺失突变菌株PEPEC O45(Δler)，并对该菌株的Vero细胞毒性、小鼠模型的安全性以及乳鼠和乳猪的被动免疫保护作用进行了研究，并证明所构建的O45(Δler)基因缺失突变弱毒菌株可作为预防PEPEC O45感染的疫苗候选株(胡奕，宋杰，赵宝华.肠致病性大肠杆菌O45基因缺失疫苗菌株的构建及其免疫原性分析[J].生物工程学报.2009(02)：181-188.)。

发明内容

本发明针对防治副猪嗜血杆菌所致动物疫病的需要，提供一种副猪嗜血杆菌aroA基因自杀载体及构建方法，该载体可用于构建筛选的副猪嗜血杆菌的弱毒力突变菌株，以作为防治疫病的疫苗候选株。

一种副猪嗜血杆菌aroA基因自杀载体，包括骨架载体和突变的aroA基因，所述骨架载体包含条件复制起点、抗生素抗性选择位点和多克隆位点，所述突变的aroA基因插入在所述多克隆位点上，所述条件复制起点指使所述自杀载体不在副猪嗜血杆菌中自主复制的起始序列，所述突变的aroA基因指aroA基因序列中插入了抗生素表达盒，所述抗生素表达盒与所述抗生素抗性选择位点为分别针对不同的抗生素选择的基因位点。

所述骨架载体的核苷酸序列如Seq ID No.1所示，带有一个R6K条件复制起点，卡那抗性选择标记位点和多克隆位点NotI、BamHI、XbaI、SalI、AccI、HincII、PstI和SphI，。

所述抗生素表达盒为具有如SEQ ID NO2所示的核苷酸序列的氯霉素表达盒。