[发明专利]一种单双酰脂肪酶、其编码基因及应用

说明书

技术领域

本发明涉生物技术领域，具体地涉及一种脂肪酶，编码该脂肪酶的基因以及该酶的应用。本发明还涉及一种异源表达该单双酰脂肪酶的方法。

背景技术

目前，酶法催化化学反应因为其反应条件温和，副产物少而逐渐替代繁琐、昂贵的化学法。

脂肪酶(E C3.1.1.3)是一类具有多种催化能力的酶，因为其可以催化水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应等多种化学反应，而成为一种重要的工业用酶，应用在生产、生活中的很多方面。

脂肪酶的应用主要包括，在面粉行业：是满足于各种面粉改良剂功能需求的首选酶制剂之一；食品增香：通过对原料中的脂肪酸的分解，转化成具有特殊香气的物质，增加产品风味；鱼片加工：用碱性脂肪酶脱去了鱼片中大量的油脂，使鱼片的保鲜、口味及色泽都有显著的提高，彻底解决碱法脱脂影响鱼片质量的难题；在洗衣粉中的应用：在洗衣粉配方中加入适量的碱性脂肪酶，并与碱性蛋白酶配伍成复合酶，不仅可以明显提高洗衣粉的去污力，而且对洗涤织物的保养，抗再污染等方面有显著效果；在皮革脱脂方面：碱性脂肪酶的专一性确保了脱脂后的皮革质量在诸多方面有明显的提高，是生产高档皮革的首选脱脂剂，而且有助于提高皮革的等级率及解决环境污染问题；在造纸行业：克服马尾松磨木浆的树脂障碍、漂白助剂、废纸张浆的油墨脱除、造纸网毯的清洗及纸厂废水处理等方面都有显著功效。目前有越来越多的微生物来源的脂肪酶被开发出来，因为其性质的不同而在不同领域中发挥着重大的作用。

单双酰脂肪酶是脂肪酶的一种，它主要以二酰甘油和单酰甘油为底物，在工业上也有十分广泛的应用，另外由于其在性质上与三酰甘油脂肪酶的互补性，还将它和三酰脂肪酶组合起来使用，可以大大提高三酰甘油的水解及转酯化效率。

目前，已知的单双酰脂肪酶数量极少，酶活普遍不高，限制了其应用。因此寻找新的具有高活性的单双酰脂肪酶，建立其高效表达体系是本领域亟待解决的问题。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种单双酰脂肪酶；

本发明的第二个目的在于提供编码上述单双酰脂肪酶的基因；

本发明的第三个目的在于提供一种可在巴斯德毕赤酵母中分泌表达单双酰脂肪酶的表达载体；

本发明的第四个目的在于提供上述单双酰脂肪酶的用途。

本发明从圆弧青霉(Penicillium cyclopium)菌株中克隆到一个新的单双酰脂肪酶(mono-and diacylglycerol lipase，MDL)基因mdl₍₉₎，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，该基因全长为840bp，分析表明，GC含量为56.1％，编码279个氨基酸组成的蛋白。由该基因编码的单双酰脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。该蛋白大小约39kD，活性中心是145位Ser，199位Asp和259位His。实验表明由该基因编码的单双酰脂肪酶具有较高的酶活。通过酶学性质测定，该酶的最适反应温度为45℃，最适反应pH值为6.0，在中性偏碱性条件下稳定。为便于表述，将该单双酰脂肪酶命名为Mdl₍₉₎。

应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的单双酰脂肪酶的氨基酸序列(SEQ ID No.2)，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。例如在非活性区段，将第25位的Asp替换为Ala。因此，本发明单双酰脂肪酶还包括SEQ ID No.2所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸，具有与Mdl₍₉₎同等活性的由Mdl₍₉₎衍生得到的蛋白质。本发明基因包括编码所述蛋白的核酸序列。

此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。因而，本发明单双酰脂肪酶基因还包括由SEQ ID No.1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸，得到编码Mdl₍₉₎的核苷酸序列。

可将本发明基因与表达载体可操作地连接，得到能够表达本发明蛋白的重组表达载体，进一步将该重组表达载体导入恰当的宿主细胞中，获得表达本发明Mdl₍₉₎的基因工程菌。