[发明专利]一种抗三聚氰胺的单克隆抗体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗三聚氰胺的单克隆抗体及其应用。

背景技术

三聚氰胺(英文名：Melamine)，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，性状为纯白色单斜棱晶体，无味。简称三胺，俗称蜜胺、蛋白精，又叫2，4，6-三氨基-1，3，5-三嗪、1，3，5-三嗪-2，4，6-三胺、2，4，6-三氨基脲、三聚氰酰胺、氰脲三酰胺，分子式见式(I)；

三聚氰胺是一种用途广泛的基本有机化工中间产品，最主要的用途是作为生产三聚氰胺甲醛树脂(MF)的原料。三聚氰胺还可以作阻燃剂、减水剂、甲醛清洁剂等。但是它被禁止用于食品和宠物饲料中，长期摄入三聚氰胺会造成生殖、泌尿系统的损害，膀胱、肾部结石，并可进一步诱发膀胱癌。

2007年，美国爆发宠物食品受污染事件。事后调查表明：掺杂了≤6.6％三聚氰胺的小麦蛋白粉是宠物食品导致中毒的原因。2008年9月，中国爆发三鹿婴幼儿奶粉受污染事件，导致食用了受污染奶粉的婴幼儿产生肾结石病症，其原因也是奶粉中含有三聚氰胺。

目前，三聚氰胺检测已经被列入我国新食品检测标准，并制定三聚氰胺在乳与乳制品中的管理限量值。婴幼儿配方乳粉中三聚氰胺的限量值为1mg/kg；液态奶(包括原料乳)、奶粉、其他配方乳粉中三聚氰胺的限量值为2.5mg/kg；含乳15％以上的其他食品中三聚氰胺的限量值为2.5mg/kg。现有的检测方法有主要为高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱/质谱法，这些检测方法涉及到使用大型精密仪器，需要专业人员操作，耗时较长，检测费用高昂。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗三聚氰胺的单克隆抗体及其应用。

本发明保护保藏编号为CGMCC NO.3237的杂交瘤细胞株3B11。

杂交瘤细胞株3B11已于2009年08月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区大屯路)，保藏登记号为CGMCC No.3237。

本发明还保护一种抗三聚氰胺的单克隆抗体，是由保藏编号为CGMCC NO.3237的杂交瘤细胞株3B11分泌产生的。

所述单克隆抗体可应用于检测三聚氰胺。

本发明还提供了一种应用所述单克隆抗体检测三聚氰胺的方法，是通过竞争ELISA检测待测样品中的三聚氰胺。

所述方法中，所述单克隆抗体的稀释度具体可为1∶10。

所述方法中，包被抗原可为式(II)所示化合物和载体蛋白的偶联物；

所述式(II)所示化合物和载体蛋白的偶联物中，式(II)所示化合物和载体蛋白的物质的量的比值具体可为20∶1。

所述载体蛋白具体可为牛血清白蛋白。

所述方法中，所述包被抗原的浓度具体可为0.2μg/mL。

本发明基于免疫学中抗原与抗体特异性反应的原理，制备出了抗三聚氰胺的单克隆抗体，并应用其建立了一种特异性、快速、简单的检测三聚氰胺的方法。单克隆抗体：通过偶联剂1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐介导的缩合反应把三聚氰胺的类似物SM(用一个碳原子取代三聚氰胺的含氮杂环中的一个氮原子，并在此碳原子上连接一个带有羧基的侧链)偶联到载体蛋白(匙孔血蓝蛋白KLH或牛血清白蛋白BSA)；用SM-KLH作为免疫抗原，取免疫小鼠的脾脏，分离出淋巴细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0进行融合，HAT选择性培养基初步筛选出融合的杂交瘤细胞，间接竞争酶联免疫法筛选出阳性杂交瘤细胞3B11，有限稀释法对3B11细胞进行亚克隆化，获得稳定分泌单克隆抗体的细胞株；采用单层细胞培养法培养细胞株，获得培养上清中的单克隆抗体；也可采用体内诱导法制备细胞株分泌的腹水抗体，然后用Protein A蛋白亲和层析法纯化腹水，得到单克隆个抗体。检测三聚氰胺的方法(间接竞争ELISA)：SM-BSA作为包被抗原被固定在酶标板上；用含10％小牛血清的磷酸盐缓冲液37℃封闭1小时；每孔分别加入系列浓度的三聚氰胺标准品和抗三聚氰胺抗体的工作液各50μL，37℃孵育0.5小时；每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体工作液，37℃孵育0.5小时；OPD显色系统显色；酶标仪在吸收波长490nm，读出A₄₉₀值；以三聚氰胺标准品浓度为x轴，抑制率(B/B₀值)y轴，绘制标准曲线；同样，用待测样品液代替三聚氰胺标准品溶液，进行间接竞争ELISA，根据标准曲线计算出样品中的三聚氰胺浓度。