[发明专利]一种利用胶体金相互聚集检测生物素标记的DNA的方法

权利要求书

1.一种基于不同生物分子修饰的胶体金相互聚集的检测生物素标记的DNA的方法，其特征 是步骤为：(1)胶体金的制备；(2)DNA修饰的胶体金的制备；(3)链霉亲和素修饰的胶体金的 制备；(4)不同生物分子修饰的胶体金相互聚集及银染实验；(5)扫描及数据分析；

(1)胶体金的制备：利用Frens法制备13nm的胶体金；

所用的玻璃仪器使用铬酸洗液浸泡后，双蒸水清洗，烘干备用；制备时向500mL烧杯中加入 1％氯化金溶液7.5mL，再加入超纯水至250mL，加热；将溶液加热至沸腾后，立即加入6.25mL 1％柠檬酸三钠溶液，继续加热，搅拌，沸腾15分钟后，停止加热；这一过程中可观察到溶 液的颜色由黄色变为深紫色，进而变为透明的深红色；冷却至室温后，将胶体金用微孔滤膜 进行过滤，4℃保存；

(2)biotin标记的DNA修饰的胶体金的制备：利用巯基与胶体金的相互作用，将biotin标记的 DNA修饰到胶体金表面；

向1mL的AuNP中加入30μL100μM的5’巯基修饰的ssDNA，避光摇一段时间，然后向溶 液中加入10.8μL 0.5M的磷酸缓冲液和2M的NaCl溶液使其Na⁺浓度递增，当Na⁺浓度升至 0.1M，停止反应，再加入小牛血清白蛋白封闭，1h后离心；离心结束后，弃上清，将红色油 状沉淀溶解于PBST中；然后向溶液中加入30μL100μM的5’biotin修饰的ssDNA，16h后 离心，弃上清，沉淀溶解于PBS中；

(3)链霉亲和素修饰的胶体金的制备：利用蛋白质与胶体金的静电吸附作用将链霉亲和素修饰 到胶体金表面；

向1mL的AuNP中加入40μL 0.5μg/μL的链霉亲和素(SA)，避光摇一段时间，向溶液中加入 2M的NaCl溶液使其Na⁺浓度递增，升至0.1M后，加入小牛血清白蛋白封闭，1h后离心； 弃上清，将红色油状沉淀溶解于PBS缓冲液中；

(4)不同生物分子修饰的胶体金相互聚集及银染实验：利用生物素与链霉亲和素的相互作用， 使两种不同修饰的胶体金发生聚集，使信号放大，然后进行银染进一步增强信号；

将5’biotin修饰的ssDNA稀释成1×10^3.0nM，1×10^2.5nM，1×10^2.0nM，1×10^1.5nM，1×10^1.0nM， 1×10^0.5nM，，分别取1μL点于醛基基片上，对照组使用无修饰的ssDNA；将基片置于恒温 恒湿环境中反应16h；然后将基片置于鲑精DNA封闭液中封闭；封闭结束后用PBST洗三次； 向反应池中加入1ml的链霉亲和素修饰的胶体金(SA-AuNP)，孵育2h；之后用PBST洗三次； 再向反应池中加入1ml的biotin标记的DNA修饰的胶体金(DNA-AuNP)，孵育2h；之后用 PBST洗三次；重复上述孵育过程，孵育结束后对基片进行银染；对照组分别仅使用AuNP， DNA-AuNP和SA-AuNP孵育；

(5)扫描及数据分析；

将银染后的基片进行扫描，使用ImageJ软件分析其灰度值，使用oringe6.0软件分析其线性 相关系数及相对标准偏差。