[发明专利]苏云金芽孢杆菌Cry9E基因，蛋白及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及对小菜蛾、玉米螟高效的苏云金芽孢杆菌CRY9EE 基因，蛋白，以及它们的应用。

背景技术

虫害是造成农作物减产的重要原因之一，减少虫害的损失是增加粮食与饲料作物产量的 重要途径。据统计全球粮食与饲料作物总产量每年因虫害造成的损失达14％，直接给农业生产 造成的经济损失高达数千亿美元。我国每年因虫害造成的损失水稻减产10％、小麦减产20％、 棉花减产30％以上[夏启中，张明菊，抗植物虫害基因及其应用，鄂州大学学报，2005，(5)： 56-60.]。采用喷施化学农药和生物杀虫剂等防治手段固然可以减轻害虫对农作物的为害，但 化学农药造成环境污染，生物杀虫剂成本较高。长期以来，大量喷施化学杀虫剂，不仅会增强 害虫的抗药性，使益虫及其它生态区系遭受破坏，而且严重污染环境，提高生产成本，破坏生 态平衡。因此，减少杀虫剂使用量，发展现代植物保护技术，已成为可持续发展农业中必须正 视的课题之一。

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种分布广泛的革兰氏阳性细菌，是 一种对害虫毒力强且对天敌无毒性的昆虫病原微生物，对高等动物和人无毒性。它是目前研 究最为深入、使用最为广泛的微生物杀虫剂，对16个目3000多种害虫有活性。Bt在芽孢形 成期可形成杀虫晶体蛋白(Insecticidal CrystalProteins，ICPs)，也称δ-内毒素(delta-endotoxin)， 它的形状、结构和大小均与其毒力有着密切关系[Schnepf.E，Crickmore.N，Van Rie.J.，Lereclus. D，Baum.J，Feitelson.J，Zeigler.D.R.，Dean.D.H.Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins.Microbiol.Mol.Biol.Rev，1998，62(3)：775-806.]。自1981年Schnepf等克隆了Bt的第 一个ICPs基因，并于1985年发表了它的DNA碱基序列及其编码蛋白的氨基酸序列起，截止 2008年6月已发现和克隆了412种ICPs基因。苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白因其杀虫效果 好、安全、高效等优点而被广泛的应用于虫害防治。

1996年全世界第一例转基因抗虫植物在美国获准应用，它使用的基因来自Bt cry1Ac。在 接下来的几年里，转cry1Ab基因的抗虫玉米，转cry3Aa基因的抗虫土豆等相距问世。在中国， 自1998年开始正式推广含有cry1Ac/cry1A基因的抗虫棉以来，已经被普遍种植。在转基因作 物商业化的第一个12年(1996-2007)中，由于能得到持续稳定的收益，农民种植转基因作物 量逐年增加。2007年，全球转基因作物种植面积增长率达12％，即增加1230万hm2，达到1.143 亿hm2(2.824亿英亩)。第一个12年，转基因作物商业化给工业化国家和发展中国家的农民都 带来了经济和环境效益。

由于目前商品化的转基因抗虫作物的抗虫基因种类比较单一，如此大面积推广种植存在 害虫避难所减少与害虫抗药性上升的风险。因此需要不断分离高毒力的或者新的基因组合来 避免害虫抗药性上升的风险。

因此，筛选分离克隆新的、高毒力的Bt杀虫基因，可以丰富杀虫基因资源，为转基因作 物与工程菌株提供新的基因来源，提高Bt转基因产品的抗虫效果，并且可以降低害虫对Bt毒 蛋白的抗性风险，避免新的生态灾难降临，具有重要的经济、社会和生态效益。

发明内容

本发明提供一种对新的对小菜蛾、棉铃虫、粉纹夜蛾、甜菜夜蛾、玉米螟、二化螟等鳞 翅目害虫具有高毒力的苏云金芽孢杆菌CRY9E基因和晶体杀虫蛋白，以应用于转化微生物和 植物，使之表现出对相关害虫的毒性，并克服、延缓害虫对工程菌和转基因植物的抗药性产 生。

一种杀虫蛋白，其氨基酸序列如SEQ NO.5所示。

编码该杀虫蛋白的基因。

该基因为Cry9Ee1，其核苷酸序列如SEQ NO.2所示。

该杀虫蛋白，其氨基酸序列如SEQ NO.6所示。

编码该杀虫蛋白的基因。

该基因为Cry9Eb2，其核苷酸序列如SEQ NO.3所示。

上述杀虫蛋白在杀灭鳞翅目害虫中的应用。

一种杀虫剂，其特征在于；含有有效量的杀虫蛋白。

上述基因在抗鳞翅目害虫中的应用。