[发明专利]一种猪内源性反转录病毒载体及其构建方法

权利要求书

1.猪内源性反转录病毒载体PM-1，由下列DNA元件组成：

1)PERV的5’LTR启动子；

2)MSCVneo的延伸包装信号；

3)小鼠磷酸甘油酸脂激酶启动子及位于PGK启动子下游并受其调控的新霉素抗性基因；

4)PERV的聚嘌呤区域PP及其3’LTR启动子；

5)大肠杆菌质粒骨架，包括大肠杆菌和氨苄青霉素抗性β内酰胺酶基因。

2.根据权利要求1所述的猪内源性反转录病毒载体PM-1，其特征在于：所述反转录病毒载体PM-1的核苷酸序列如序列表中序列11所示。

3.权利要求1所述猪内源性反转录病毒载体PM-1的构建方法，包括以下步骤：

1)按照猪PERV全基因序列与MSCVneo序列设计5对引物，扩增P-5’LTR片段的引物对具有序列表中序列1和序列2的核苷酸序列，扩增ψ片段的引物对具有序列表中序列3和序列4的核苷酸序列，扩增P-3’LTR片段的引物对具有序列表中序列5和序列6的核苷酸序列，扩增neo片段的引物对具有序列表中序列7和序列8的核苷酸序列，扩增O-Amp片段的引物对具有序列表中序列9和序列10的核苷酸序列，然后PCR扩增得到P-5’LTR、ψ、P-3’LTR、neo和O-Amp片段；

2)通过重叠PCR技术及酶切连接的方法构建出猪内源性反转录病毒载体PM-1。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：所述步骤1)的PCR反应体系包括：0.5μl cDNA(100ng/μl)，引物R和F各1μl(20μM)，4μl dNTP(2.5mM)，0.5μl Super-L taq DNA聚合酶，5μl 10×PCR Buffer，38μl灭菌水；PCR反应条件为：先94℃变性3min；然后94℃ 30s，56℃ 45s，72℃ 1min30s，30个循环；最后72℃ 7min。

5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：所述步骤2)的重叠PCR的反应体系包括：0.5μl cDNA 1(100ng/μl)+0.5μl cDNA 2(100ng/μl)，引物R和F各1μl(20μM)，4μl dNTP(2.5mM)，0.5μl Super-L taq DNA聚合酶，5μl 10×PCR Buffer，37.5μl灭菌水；反应条件为：先94℃变性3min；然后94℃ 30s，56℃ 1min，72℃ 1min 30s，30个循环；最后72℃ 7min。

6.含有权利要求1或2所述猪内源性反转录病毒载体PM-1的表达载体、转基因细胞系或宿主菌。

7.一种表达外源基因的方法，是在权利要求1或2所述在猪源细胞中特异表达或可在其它哺乳动物细胞表达的质粒型反转录病毒载体PM-1的多克隆位点处插入其它外源基因，当转染细胞后可被包装成复制缺陷型的猪内源性反转录病毒粒子，直接感染体外培养的细胞系，在细胞系中表达外源基因。