[发明专利]用于评价HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制剂的融合蛋白及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物领域，涉及HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制剂的评价体系，特别是涉及一种可用于评价HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶活性的融合蛋白及其应用。

背景技术

丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，HCV)正严重危害着人类健康。我国HCV感染者已达6000万。HCV急性感染后50-80％转变为慢性感染，其中的10-20％发展成肝硬化，并与肝细胞癌的发生密切相关。HCV为单股正链RNA病毒，属黄病毒科，全长约9600个核苷酸，ORF区编码3010个氨基酸的多聚蛋白前体，经过宿主和病毒本身基因编码的蛋白酶裂解为十个功能性片段，包括4个结构蛋白(核心蛋白C、包膜蛋白E1、E2以及P7)及6个非结构蛋白(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)。

HCV NS3/4A蛋白具有丝氨酸蛋白酶活性，参与病毒蛋白翻译后加工，在NS4A的辅助下能催化裂解NS3-NS4A、NS4A-NS4B、NS4B-NS5A和NS5A-NS5B的连接点，对HCV非结构蛋白的成熟起到关键作用。因此，抑制HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶活性，可阻止HCV非结构蛋白的成熟。HCV NS3/4A抑制剂，可成为抗丙型肝炎病毒药物。

多年来，针对HCV NS3/4A抑制剂的研究取得可喜的进展，但由于缺乏理想的评价体系，这些药物抗HCV的作用效果难以作出评估，极大地延缓了这些药物进入临床，因而建立一种理想的适用于HCV NS3/4A蛋白抑制剂筛选及评价体系迫在眉睫。

发明内容

本发明提供了一种用于评价HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶活性的融合蛋白。

本发明所提供的用于评价HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶活性的融合蛋白，是以萤火虫荧光素酶为报告基因，两个可紧密结合的小分子多肽分别与N端和C端的萤火虫荧光素酶片段结合，中间由NS3/4A丝氨酸蛋白酶作用底物相连，然后将此融合基因插入真核表达载体形成指示载体后表达产生。

所述两个小分子多肽pepA和pepB为可紧密结合且不影响细胞功能的蛋白分子；所述NS3/4A丝氨酸蛋白酶作用底物为NS3/NS4A、NS4A/4B、NS4B/NS5A、NS5A/NS5B的连接点。

所述指示载体的表达在体外细胞水平表达，或通过转基因的方式在动物体内表达。

具体来讲，所述NS3/4A丝氨酸蛋白酶作用底物为NS5A/NS5B的连接点的融合基因可命名为ANluc-NS5A/B-BCluc，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：2的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸序列；

3)与序列表中SEQ ID NO：2限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有评价HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶活性作用的核苷酸序列；

4)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID NO：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为杂交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。

序列表中的SEQ ID NO：2由1923个碱基组成，其编码序列为自5’端第7位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第10位碱基编码pepA，自5’端第76位碱基编码N端的萤火虫荧光素酶片段，自5’端第1330位碱基编码NS5A/NS5B的连接点，自5’端第1371位碱基编码pepB，自5’端第1461位碱基编码C端的萤火虫荧光素酶片段。

上述融合基因ANluc-NS5A/B-BCluc编码的融合蛋白，是下述氨基酸残基序列之一：

1)序列表中的SEQ ID NO：1；

2)将序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加并具有评价HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶活性作用的蛋白质。

序列表中的SEQ ID NO：1由636个氨基酸残基组成，自氨基端第2位氨基酸残基为pepA，自氨基端第24位氨基酸残基为N端的萤火虫荧光素酶片段，自氨基端第442位氨基酸残基为NS5A/NS5B的连接点，自氨基端第455位氨基酸残基为pepB，自氨基端第486位氨基酸残基为C端的萤火虫荧光素酶片段。