[发明专利]一种单分散性磁性人铁蛋白的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于磁性纳米材料的仿生合成技术领域，具体地涉及一种单分散性的磁性人铁蛋白的制备方法。

背景技术

超顺磁磁铁矿(Fe₃O₄)或者磁赤铁矿(γ-Fe₂O₃)由于其优良的磁性能以及纳米尺寸效应，被广泛地应用于电子学(高密度磁存储)、化工(磁流体、催化、涂料)、环境学(环境修复)和生物医学(磁靶向药物、磁共振造影增强剂、细胞标记分离、DNA分离、疾病诊断)等领域。但是在纳米磁性颗粒的制备领域中，如何合成粒径均一、形状相同、分散性好和单分散性的纳米磁性颗粒一直是研究的热点。

铁蛋白是天然的铁矿化蛋白，它广泛分布于微生物、植物、动物以及人体内，在机体内发挥着解除二价铁离子的毒性以及贮铁的功能，在机体内的铁代谢以及铁的生物矿化过程中发挥着至关重要的作用。天然铁蛋白由于蛋白亚基的高度自组装，能够形成球形的笼状蛋白壳结构，其外直径约为12nm，内直径约为8nm，尺寸高度均一。每个笼型的蛋白壳内部含有一铁核，天然铁蛋白的铁核约为6-8nm，其成分是反铁磁性的水合氧化铁。天然铁蛋白的铁核在酸性条件以及还原剂存在的条件下进行释放从而形成空壳铁蛋白，而且由于空壳铁蛋白仍然保持其均一的笼型结构，所以能够作为纳米材料仿生合成的模板，合成的纳米材料通常具有尺寸均一、形状相似、分散性好和具有天然的蛋白壳等优点。

磁性铁蛋白是一种仿生合成材料，是一种具有磁铁矿或者磁赤铁矿内核的铁蛋白。传统的磁性铁蛋白的合成通常是以天然铁蛋白为原料，首先在酸性条件和还原剂存在的条件下将原来的水合氧化铁铁核去除，形成空壳铁蛋白，然后再通过化学条件的改变在蛋白壳内部形成磁铁矿或者磁赤铁矿颗粒(U.S.patent 5491219)。但是这种传统合成磁性铁蛋白的路线通常需要去除铁核形成空壳铁蛋白这一步骤，这种步骤因为在酸性条件下完成，容易造成蛋白壳的损伤；另外由于这个过程的繁琐，蛋白的损失量也会增大。而且前人的研究也同样表明，这种传统方法合成的磁性铁蛋白容易聚集，存在磁相互作用(Moskowitz et al.，1997)。这种聚集不仅可以影响磁性颗粒的磁学性质，而且还会影响其在生物医学中的应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种单分散性磁性人铁蛋白的制备方法。

为实现上述目的，本发明提供的单分散性磁性人铁蛋白的制备方法，以重组人铁蛋白为模板，通过仿生合成，在重组人铁蛋白的内部形成磁性纳米颗粒，经过分离纯化得到单分散性磁性人铁蛋白，主要步骤如下：

1)以重组人铁蛋白为模板，将人铁蛋白的H亚基和L亚基的全长cDNA分别克隆和构建到质粒上；

2)将含有人铁蛋白H亚基和L亚基的重组质粒分别转化或者共转化细菌Rosetta(DE3)pLysS，加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)激活T7启动子，诱导表达；

3)表达结束后进行超声破碎释放蛋白；

4)对蛋白进行分离和纯化；

5)将亚铁盐和氧化剂加入重组人铁蛋白的溶液中进行反应，控制pH值为7～11，控制温度为25～80℃，在重组人铁蛋白内部形成强磁性的纳米颗粒；亚铁盐的浓度为每次加入的亚铁原子数与蛋白分子数之比在10～200之间，最终每个蛋白分子加入的铁原子数可在100～5000之间；氧化剂的浓度为每次加入H₂O₂的分子数与加入亚铁离子的原子数之比为2∶1或3∶1；蛋白浓度＞0.25mg/ml；

6)排阻层析进行分离，离心和分子筛纯化后得到单分散磁性人铁蛋白颗粒。

本发明的制备方法中，重组人铁蛋白包括重组人铁蛋白的H链、重组人铁蛋白的L链、重组人铁蛋白的H链和L链的组装体、重组人铁蛋白的H链的突变体或融合蛋白和重组人铁蛋白的L链的突变体或融合蛋白。

本发明的制备方法中，步骤1之后，对编码序列进行测序保证具有正确的DNA序列。

本发明的制备方法中，步骤2中，是当细菌繁殖到OD值为0.7时，再加入IPTG激活T7启动子，在37℃诱导表达。

本发明的制备方法其中，步骤3中，是细菌重悬在Tris-HCl缓冲溶液中进行超声破碎释放蛋白。

本发明的制备方法和，步骤4中，采用层析方法、硫酸铵沉淀、离子交换或分子排阻层析分离蛋白。

本发明的制备方法中，步骤5中，亚铁盐和氧化剂为水溶性亚铁盐：硫酸亚铁、硫酸亚铁铵或氯化亚铁；氧化剂为双氧水。