[发明专利]DNA修复蛋白RAD51在制备治疗骨肉瘤表达方面的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，涉及临床常见恶性骨肿瘤的治疗方法，更具体的说DNA是修复蛋白RAD51在治疗骨肉瘤表达方面的应用。

背景技术

骨肉瘤是一种起源于间叶组织的恶性肿瘤，是骨骼系统最常见的恶性肿瘤，好发于青少年。对骨肉瘤的治疗主要是手术联合化疗，然而化疗耐药的出现对对骨肉瘤治疗提出了严峻的挑战；骨肉瘤对放疗不敏感，放疗一般仅可以用作辅助治疗和姑息性治疗；骨肉瘤的放化疗耐受，其主要原因可能是骨肉瘤细胞其DNA损伤修复功能增强。

哺乳动物细胞针对DNA双链断裂有多种修复方式。其中最主要的是HR和NHEJ。HR的正常进行需要有姐妹染色单体的存在，而催化断裂的DNA双链与完整的同源DNA姐妹链进行链间转移置换时，需要一种关键酶即RAD51蛋白。

实验表明当Rad51蛋白水平异常升高时，可严重干扰通过效应性半胱天冬酶Caspase-3所介导的细胞凋亡途径，使肿瘤细胞在出现DNA损伤后，能够在抗凋亡BCL-2家族蛋白共同作用下避免细胞凋亡的产生。同时，Rad51的升高还可以不直接经过同源重组途径，而通过其他方式干扰正常的细胞周期。肿瘤细胞内Rad51蛋白水平的异常升高，可造成肿瘤对放疗及化疗的抵抗，包括射线、顺铂、氮芥、苯丁酸氮芥、丝裂霉素C、羟基脲、吉西他滨等。Rad51蛋白表达水平的失调也可促进肿瘤的发生和发展，并影响肿瘤的治疗效果和患者的生存率。研究者发现，RAD51的在肿瘤中的表达显著高于正常细胞质，提示靶向作用于该修复蛋白可作用增强放射敏感性的一个潜在的靶点。

目前对于Rad51在骨肉瘤细胞系中的表达及放化疗敏感性的影响，国内外的报道还很少，因此如能对Rad51在骨肉瘤细胞增殖及放化疗抵抗中的作用进行深入的探讨，将可能为骨肉瘤的治疗及增强放化疗敏感性提供一个新思路。

RNAi是一种新的基因沉寂技术，它通过双链RNA引起序列同源的mRNA的降解，降低目标基因的表达，是一项理想阻断特异基因表达技术，如将其应用于肿瘤细胞DNA修复途径关键调控基因Rad51的阻断，将收到比特异性阻断剂更理想的肿瘤放射治疗效果。

发明内容

本发明公开了一种DNA修复蛋白RAD51 pGCsi3.0-shRAD51的干扰载体，其特征在于分别将一对正义和反义的DNA寡核苷酸退火后连接哺乳动物表达载体pGCsi-U6/neo/GFP上，得到真核细胞RNA干扰质粒，见图1。

本发明根据GenBank中的RAD51 cDNA设计了靶序列，分别将一对正义和反义的DNA寡核苷酸退火后连接哺乳动物表达载体pGCsi3.0上，得到真核细胞RNA干扰质粒，见图1，其有效靶序列shRNA-2，见NO1。

本发明进一步公开了DNA修复蛋白RAD51在制备抑制骨肉瘤增殖及增强放、化疗敏感性表达方面的应用。

本发明所述的放、化疗敏感性药物包括：射线、顺铂、氮芥、苯丁酸氮芥、阿霉素、丝裂霉素C、羟基脲或吉西他滨等，典型的优选：射线、顺铂、阿霉素。

本发明所述的应用，包括DNA修复蛋白RAD51在制备抑制骨肉瘤增殖表达方面的应用，以及DNA修复蛋白RAD51在制备治疗骨肉瘤放化疗耐受力方面的应用。

本发明经过大量的药理学实验证明：(1)免疫组织化学法分析骨肉瘤组织及癌旁标本，发现RAD51蛋白在骨肉瘤组织中呈高表达，且表达水平同临床分期及病理分型无关。(2)western blotting和RT_PCR法检测骨肉瘤细胞系和人胚皮肤成纤维细胞系中RAD51蛋白表达，发现肿瘤细胞系中RAD51也呈高表达。(3)western blotting和RT_PCR法检测γ射线和顺铂、阿霉素对RAD51表达的影响，结果提示RAD51的表达同γ射线及化疗药物间有时间和剂量依赖关系。(4)检测不同RAD51表达水平的骨肉瘤细胞系的射线及化疗药物敏感性，发现RAD51表达水平同γ射线和药物敏感性均呈负相关。(5)成功构建pGCshRNA-RAD51干扰载体，并挑选出有效的靶序列。(6)经蛋白和RNA水平鉴定，成功建立了稳定的RAD51基因沉默的骨肉瘤细胞系(7)RAD51基因沉默抑制体外骨肉瘤细胞增殖，在体内抑制裸鼠移植瘤的生长。(8)RAD51基因沉默提高γ射线和顺铂、阿霉素的敏感性。RAD51基因沉默促进γ射线和药物诱导骨肉瘤细胞凋亡。

附图说明：

图1为pGCsi3.0-shRAD51真核细胞RNA干扰质粒结构图。

图2免疫组织化学检测RAD51在骨肉瘤组织中的表达。其中A骨肉瘤组织(强阳性)  B骨肉瘤组织(阳性)C骨肉瘤组织(弱阳性)D癌旁组织(阴性)。