[发明专利]一种利用加入氧载体的培养基发酵提高氧化葡萄糖杆菌生物量的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种利用加入氧载体的培养基发酵提高氧化葡萄糖杆菌生物量的方法。 

技术背景

米格列醇(migliton)是拜耳公司在1997年度上市的新型抗糖尿病药物。它是从杆菌肉汤培养基中发现的一种新型肠道α-葡萄糖苷酶抑制剂，是1-脱氧野尻霉素的母体修饰产物，属于N-取代-1-脱氧野尻霉素类型，结构与葡萄糖相似。尽管用化学合成的方法能够制备米格列醇，但化学全合成法制备米格列醇的步骤较多，米格列醇分子中含有的四个手性中心也给化学合成带来了很大的困难。目前生产规模大多采用生物合成来制备米格列醇。米格列醇的生物合成法据文献报道大致有二条路线：一是先由野尻霉素或1-脱氧野尻霉素产生菌进行发酵，制备获得野尻霉素或1-脱氧野尻霉素，然后再经过化学合成方法获得米格列醇，这是最原始的途径；二是应用氧化葡萄糖酸菌转化制备米格列醇关键中间体N-取代-1-脱氧野尻霉素，其主要通过化学合成-生物转化-化学合成的方法来制备，工艺路线见说明书附图。 

US4266025，EP0477160，USP2001/0019837公布了另外的米格列醇的生产方法，即化学合成结合生物催化的方法。但由于菌体活力不高，导致生物催化时间过长，造成生产成本高，生产周期长，给工业化生产带来很大的障碍。 

由于微生物酶的高效专一性，省略了化学合成过程中为达到专一地改造某个目的基团必须进行的加入和脱除保护基团的步骤，大大简化了制备过程，提高了反应收率。氧化葡萄糖酸杆菌用于转化特定底物制备1-脱氧野尻霉素及其衍生物具有很多优点：1)转化液 经离心除去菌体，无需分离纯化出中间体，就可进行下一步合成；2)无需基团保护，成本大大降低，且避免因去除保护剂而造成的回收率下降；3)中间体6-(取代胺基)-6-脱氧-α-L-山梨呋喃糖具有较高的溶解度和稳定性，不易被降解。但还没有对于转化机理的报道，可以肯定是，氧化葡萄糖杆菌中含有参与该转化反应的生物酶或酶系，氧化葡萄糖杆菌的催化能力与其含有的生物酶系的数量和活力有直接关系。 

目前，米格列醇虽然已经实现工业化生产，但由于菌种活力低，利用微生物将1-羟乙胺基-1-脱氧-D-山梨醇转化为呋喃型葡萄糖胺时转化效率低，转化时间长，劳动强度大，生产成本高。传统菌种选育主要采用诱变育种的方法，诱变的方法历史悠久，过去一直依赖诱变的方法来提高产量，目前大多数生物发酵工业生产仍然在使用这些方法。但是这种方法具有相当大的随机性，而且菌种若长期使用诱变剂处理，其活力会逐渐下降。 

目前，还没有利用加入氧载体的培养基发酵提高氧化葡萄糖杆菌生物量的方法的相关文献报道。 

发明内容

本发明的目的是提供一种利用加入氧载体的培养基发酵提高氧化葡萄糖杆菌生物量的方法，通过在培养基中加入合适的氧载体，提供一种氧载体发酵体系，在没有添加其它物质，没有额外能源消耗的条件下，大幅提高了培养基中的溶解氧浓度，从而使发酵生物量大幅度提高，并且并不会影响该菌种的催化能力。 

本发明采用氧化葡萄糖杆菌为微生物菌种，经过菌种培养、发酵培养离心分离得到菌丝体，其特征是发酵培养基中添加氧载体、表面活性剂，其具体步骤如下： 

具体步骤和方法如下： 

(1)菌种培养 

将氧化葡萄糖杆菌菌种接种到pH为7.0的种子培养基中，在20-30℃，150-220rpm恒温振荡培养箱中培养20-30小时。 

其中，菌种培养基含有：山梨醇50-80g/L，酵母膏10-40g/L，磷酸二氢钾0.5-2g/L。 

(2)发酵培养 

将经过培养得到的种子培养液接种到添加氧载体、表面活性剂的pH为7.0的发酵培养基中，在20-30℃，150-220rpm恒温振荡培养箱中培养36-48小时后，离心收集菌体。其中，发酵培养基含有：山梨醇50-80g/L，酵母膏10-40g/L，磷酸二氢钾0.5-2g/L； 

培养基中氧载体为正己烷或者正十二烷，氧载体与培养基的体积比为5-50∶1000。正己烷或正十二烷在这里是一种与水不互相溶解、对微生物没有毒害、具有较高溶解氧能力的氧载体；同时为了降低培养基的粘度，进一步提高溶解氧的水平，本培养基加入表面活性剂为吐温-80、硬脂酸、十二烷基苯磺酸钠中的一种或多种，每升培养基中含有表面活性剂0.2-2g，优选吐温-80。 

离心采用高速冷冻离心机，10000rpm离心15分钟。 

对所得到的菌丝体进行生物催化验证：