[发明专利]一种建立高效表达人环氧合酶2的重组人肠癌细胞株的方法及应用

说明书

技术领域

本发明属基因工程制药技术及应用领域，涉及一种建立高效表达人环氧合酶2(COX-2)的重组人肠癌HCT-116细胞株HCT-116^COX-2的方法及应用，具体地说，本发明涉及建立稳定转染含人环氧合酶2(COX-2)基因启动子编码序列和荧光素酶报告基因序列的永生化哺乳动物细胞系，通过压力筛选和基因扩增后，获得稳定、灵敏、高效表达COX-2的肿瘤克隆细胞株，并将细胞株应用于以COX-2基因为靶点的抗肿瘤药物的筛选及评价。

背景技术

研究表明，环氧化酶(cyclooxygenase，COX)是前列腺素(PGs)合成过程中一个重要的限速酶，可将花生四烯酸代谢成各种前列腺素产物，从而维持机体的各种病理生理过程。目前发现哺乳动物的环氧化酶至少有COX-1和COX-2两个同工酶，COX-1在组织中的表达相当稳定，对维持胃和肾功能的平衡发挥重要的作用，而COX-2的表达在不同的组织、不同的状况下变动很大，它的主要产物是环前列腺素和PGE₂。

现有技术公开了COX-2基因全长8.3kb，由10个外显子和9个内含子组成，定位于第1号染色体1q^25.2～25.3，由5’端0.8kb的转录起始点上游区，6kb的蛋白质编码区以及1.5kb 3’端非编码区组成，其mRNA约4.5kb，基因编码603或604个氨基酸，含有17个氨基酸残基构成的信号肽，与COX-1有59％-61％的同源性。在其5’旁侧区，含有几个可能的转录调节序列，包括转录起始位点上游25bp位处共同的TATA框序列。一个C/EBP基序，两个AP-2位点，三个SP₁位点，两个NF-κB位点，一个CRE基序和一个EST-1位点。在蛋白质编码区，COX-2基因的ORF起始于CTGCGATGC序列，由10个外显子编码。在3’旁侧区，整个3’UTR包含于外显子10，其间无内含子存在，有三个富含腺嘌呤核苷酸的序列M TAAA，相互之间相隔280bp。

COX-2发现于某些细胞中，主要定位于核膜。因此，COX-2产生的PGs产物可进入核内，调节靶细胞基因的转录。研究表明COX-2不仅是启动炎症反应的关键酶，而且其表达和与肿瘤的发生、增殖、分化、浸润、转移及预后等方面有重要作用。研究提示，COX-2主要通过以下途径导致胃癌的发生：(1)COX作为一种刺激因子在静息状态下不表达，只有在某些恶性细胞中，可能由于癌基因的激活或抑癌基因的失活而被活化，COX-2的转录后失控，使COX-2过度表达，COX-2的过氧化酶活化可催化一系列异体氧化反应，参与氧化诱癌途径，从而形成致癌物；(2)COX-2通过催化形成PGs促进肿瘤的发生，COX-2通过催化反应可产生PGG、PGH、PGE，其中PGE为其主要代谢产物，可诱导细胞增殖，促进细胞粘附，抑制具有免疫调节功能的淋巴因子的产生，抑制T细胞和B细胞增殖，降低机体对肿瘤细胞的局部免疫反应；(3)COX-2过度表达可增加PGE2的合成，PGE2诱导细胞增殖并刺激Bcl-2蛋白表达，降低介导凋亡的转化生长因子-β(TGF-β)2型受体水平，降低介导细胞间粘附的E-钙粘蛋白(E-cadherin)活性，从而抵抗各种刺激诱导的细胞凋亡，促进细胞增殖，引起肿瘤的发生；(4)COX-2促进PG合成的增加如PGE₁、PGE₂和15d-PGJ等作用于EP₂、EP₄及PPARr等，通过EP/cAMP等途径激活各种胞内激酶如PKA、Ras蛋白活性，诱导VEGFmRNA和蛋白表达水平上调，参与肿瘤新生血管的形成，促进肿瘤的转移；(5)COX-2可使细胞周期存在明显G₁期推迟，而且Cyclin D₁蛋白激酶、Rb₁激酶和细胞周期依赖激酶(CDK4)活性明显下降，这样通过阻碍细胞周期，阻止延长细胞生存期，增强对胞外基质的粘附，而异常延长细胞生存期使一系列基因突变，促进肿瘤形成。另外，COX-2可促进肿瘤细胞相关血管的生成，增加癌细胞的侵袭性，激活基质金居蛋白酶2降解细胞外基质，产生促血小板凝集的血栓烷等，从而有利于肿瘤的侵袭和转移。

COX-2在肿瘤发生、发展和转移的整个过程中起着重要的作用，参与了肿瘤形成的多个环节。因此，对肿瘤组织或肿瘤细胞中COX-2活性检测可以作为监测肿瘤的发生发展的一个重要手段，同时COX-2在细胞中的基因表达水平也可以作为抗肿瘤药物筛选的一个重要指标。