[发明专利]含内参的HCMV荧光定量PCR检测试剂盒

权利要求书

1.含内参的HCMV荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于包含一对特异性引物、一条HCMV特异性检测探针和内参探针，分别用于检测HCMV病毒核酸DNA和人工合成的内参DNA片段，

其中，用于检测HCMV病毒DNA的扩增片段长度为96bp，引物和探针序列如下：

引物1：5`-GACTTCTTCACCCTGTTCTTCC-3`      (Seq No.1)

引物2：5`-GAGCCCGACTTTACCATCCA-3`        (Seq No.2)

探针1：5`-CTATCAGAGATCACGATACAGCCGG-3`   (Seq No.3)

探针2：5`-CACTCAACCTACACGTCAACGCTA-3`    (Seq No.4)

或者上述引物序列的互补序列，或者上述序列同源性大于75％的序列。

2.含内参的HCMV荧光定量PCR检测试剂盒其特征在于使用人工合成的内参DNA片段，内参DNA片段除探针1的结合区域更换成探针2的结合区域外，其余部分与HCMV DNA的扩增序列最好完全相同，但亦可完全不同。内参DNA片段序列如下：

内参阳模：

5`- GACTTCTTCA CCCTGTTCTT CCTCGCACTC AACCTACACG TCAACGCTAC GGTATCGATA ATCTTGTTGCGGTACTGGAT GGTAAAGTCG GG

3.含内参的HCMV荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于内参DNA片段预先加入到含探针1和探针2的组成成分“探针”中，试剂盒的组成成分包括：PCR反应缓冲液、探针、Taq酶、核酸提取液、校准品1、校准品2、校准品3、阳性对照品和阴性对照品。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于两条标记探针的荧光发光基团不同，根据不同的荧光定量PCR仪器，从以下荧光基团中选择两个分布于不同的仪器检测通道的两种荧光进行组合，荧光种类为FAM、TET、JOE、Cy3、Cy5、Cy5.5、Fluorescein、Rhodamine、Rhodamine Red、Rhodamine Green、Rhodamine 6G、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Texas Red、TAMRA、Inosine、HEX、FITC、Acridine orange和ROX；荧光淬灭基团根据选择的荧光发光基团的种类和组合从DABCYL、DABSYL、TAMRA、BHQ-1、BHQ-2或BHQ-3中的选择一种或两种淬灭基团。优选的方案为：两条探针分别用FAM-BHQ1和TET-BHQ1进行标记。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于PCR反应体系包含Tris-HCl(PH 8.3)、KCl、d(AGC)TP、dUTP、MgCl₂、引物1和引物2、探针1和探针2、Taq酶、UNG酶以及适当浓度的内参阳模，试剂盒校准品为已知核酸DNA浓度并包含引物1和引物2扩增片段的人工合成DNA片段，阳性对照品为适当浓度的AD169标准病毒株，阴性对照品为超纯水。校准品序列如下：

5-GACTTCTTCA CCCTGTTCTT CCTCGCTATC AGAGATCACG ATACAGCCGG CGGTATCGAT AATCTTGTTGCGGTACTGGA TGGTAAAGTC GGGCTC-3`(Seq No.6)

6.根据权利要求3所述的试剂盒其特征在于，按如下程序进行实时荧光PCR检测：反应管先在50℃反应2分钟，然后95℃保温5分钟，再按94℃20秒→60℃45秒循环40次(60℃退火条件下采集相应探针标记通道的荧光)。