[发明专利]具有多种活性作用的海胆共附生菌株的分离纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种菌株的分离纯化方法，特别是一种具有多种活性作用的海胆共附生菌株的分离纯化方法。

背景技术

海胆(echinus)是一种棘皮动物，长着一个圆圆的石灰质硬壳，全身长满硬刺，形状有心形、半球形、盘形等，壳直径一般为6～10cm，大者达30～40cm。大都生活在浅海岩礁底或石缝中，有背光和昼伏夜出习性，主要以海藻类和小动物等为食。因海胆全身长满可动的棘刺，故有“海刺猬”之称。海胆种类较多，据记载，全球共有850多种，主要食用品种有：紫海胆、心形海胆，主要养殖品种有：紫海胆、马粪海胆。海胆的营养价值很高，其体内的生殖腺，称为海胆卵，又称海胆黄、海胆膏。海胆卵有生殖和储存营养的作用，又是种特殊风味的美食，是海洋食品中名贵的珍品。海胆卵不仅味美而且营养丰富，蛋白质含量15.8％，脂肪含量为8.5％，糖类含量为2.2％还有多糖、磷脂、维生素、氨基酸和矿物质等等。

海胆不但具有较高的食用价值，同时还有极好的药用功能，尤其对心血管疾病有较好的防治效果。中医认为，海胆黄有强精、壮阳、益心、强骨、补血的功效。海胆具有化痰消肿，治疗白血病，抗肿瘤，雄性激素样，毒性作用等功效。而海洋动植物共附生的微生物提高了宿主在海洋中的生存能力和适应能力，产生了抑制竞争关系生物体的生长。如抗生素、多糖、酶等都是其中产生的。人们对从海洋环境中极其多样性的微生物中开发新的特效药寄予极大的希望。

发明内容

本发明的目的是提供一种步骤简单、好操作、易控制的具有多种活性作用的海胆共附生菌株的分离纯化方法，为该菌株的发酵产物在药品、生物农药和食品保鲜、防腐剂和化妆品的添加剂方面的开发利用提供方便。

本发明的具有多种活性作用的海胆共附生菌株的分离纯化方法，其特征在于：取一个海胆用无菌海水冲洗干净，研磨碎后加入无菌水，静置沉淀，取上清液滴加在牛肉膏蛋白胨海水固体培养基上，用三角棒涂布均匀，在37℃下培养2天，在原培养基上挑取单个形态各异的菌落，在牛肉膏蛋白胨海水固体培养基上划线培养，重复上述步骤，直到有纯菌株出现为止并编号，移入斜面和液体牛肉膏蛋白胨培养基中培养1天，冰箱保存备用。

本发明的具有多种活性作用的海胆共附生菌株的分离纯化方法，具有工艺步骤简单、好操作、易控制的优点，本方法分离的纯菌株的发酵产物在药品、生物农药和食品保鲜、防腐剂和化妆品的添加剂方面的开发利用提供方便。

具体实施方式

取一个海胆用无菌海水冲洗3次后，用剪刀剪片研磨碎后加入少量无菌水，静置沉淀，取上清液滴加在牛肉膏蛋白胨海水培养基上，用三角棒涂布均匀，作三个重复。37℃下培养2天，根据观察结果，在原培养基上挑取单个形态不一样菌落，再次在牛肉膏蛋白胨培养基上划线培养，之后观察生长情况。重复以上步骤，直到有纯菌株出现为止并编号。移入斜面和液体牛肉膏蛋白胨培养基中培养1天，冰箱保存备用，应用生理生化方法对该活性菌株鉴定，结果属于盐杆菌属。

滤纸片法检测抑菌活性，邻苯三酚法检测超氧阴离子自由基(O^2-)清除作用，Fenton法检测羟自由基(·OH)清除作用，大豆子叶法测定植物诱抗活性。结果表明该菌株的发酵产物可以作为治疗和预防清除体内过氧化物的药物或保健食品，能与辅料混合形成各种形式的丸剂、散剂、片剂、膏剂，粉剂、水剂，颗粒剂、胶囊等；可以作为治疗皮肤表浅创伤的药物或应用于化妆品的添加剂，在使用时可以采取经涂抹或非喷施的给药方式，使用可以任意选用生理盐水，稳定剂，悬浮剂或乳化剂等；可以作为诱导植物抗性的生物农药，农药形态可以是液体也可以是粉剂；可以作为食品防腐剂、保鲜剂和抗氧化剂应用于食品领域。

具体实例如下：

实例1

取一个海胆用无菌海水冲洗3次后，用剪刀剪片研磨碎后加入少量无菌水，静置沉淀，取上清液滴加在牛肉膏蛋白胨海水培养基上，用三角棒涂布均匀，作三个重复。37℃下培养2天，根据观察结果，在原培养基上挑取单个形态不一样菌落，再次在牛肉膏蛋白胨培养基上划线培养，之后观察生长情况。重复以上步骤，直到菌株纯化。纯化的菌株接入液体牛肉膏蛋白胨培养基，37℃培养一天，发酵产物用除菌滤膜过滤，冰箱保存用于检测活性。

实例2