[发明专利]大白菜PHK4蛋白编码序列及其功能验证

说明书

技术领域：

本发明属于分子生物学和基因工程领域。具体涉及到大白菜PHK4蛋白的编码序列及其功能验证。

背景技术：

在高等植物中，细胞分裂素广泛参与了对植物生长发育的调控，包括参与配子细胞与胚胎发育；促进芽的分化；调控顶端优势、抑制主根的伸长；促进维管束的形成、花和果实的发育；参与胁迫反应和病原抵抗以及延缓开花时间和叶片衰老等。

细胞分裂素的调控作用是通过信号网络实现的。细胞分裂素受体负责细胞分裂素信号的感应和转导，是信号传递的起始点。

大白菜是一种重要的蔬菜作物。分离大白菜的细胞分裂素受体基因，将为利用基因工程手段调控大白菜的株型、单株重、生育期、根系发育，提高大白菜耐生物/非生物胁迫能力奠定重要基础。

目前已公布的大白菜基因组测序结果尚不完整，大白菜细胞分裂素受体PHK4(pekinensis histidin kinase4)蛋白的编码序列至今在国内外未见报道。

发明内容：

本发明公开了大白菜细胞分裂素受体PHK4蛋白质的氨基酸序列以及该蛋白的编码基因的核苷酸序列及其功能验证。

本发明解决技术问题所采用的技术方案是：

本发明分离出了多核苷酸，其序列特征是：序列全长3156bp，编号为SEQ ID NO：1。该分子含有大白菜细胞分裂素受体PHK4蛋白的编码序列。

本发明提供的蛋白质多肽，其特征是：具有SEQ IDNO：2氨基酸序列。

本发明提供了包含上述多核苷酸的载体。

本发明提供了一种上述载体转化或转导的宿主细胞，在实例中该宿主细胞是大肠杆菌感受态细胞、农杆菌感受态细胞、酵母Δsln1突变体和拟南芥ahk4-1突变体。

本发明提供了一种利用转基因技术将PHK4基因转化入酵母突变体Δsln1和拟南芥ahk4-1突变体来验证PHK4具有细胞分裂素受体功能的方法。

具体实施方式：

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1

大白菜细胞分裂素受体PHK4的基因组编码序列的分离

用已知的十字花科植物细胞分裂素受体基因cDNA序列，通过比较，得到相似性较高的一段大白菜的EST序列，在其上设计引物进行反向PCR扩增，得到该EST序列两侧未知序列，通过染色体步移技术进一步向一端延伸，扩增出3’端未知序列，再通过与基因序列库的比对分析，寻找基因相似性较高的序列，在其上设计引物，通过常规PCR扩增获得5’端序列，拼接后获得一段全长为8474bp的DNA序列。该序列包含PHK4蛋白的基因组编码序列。

详细过程如下：

1、植物基因组DNA的环化

提取植物基因组DNA，利用限制性内切酶对基因组DNA进行酶切，然后通过T4DNA Ligase使酶切片段进行自身环化。

2、反向PCR

设计反向PCR引物，引物序列为：

P1：5’-GGATATTCAAATGCCACAG-3’(SEQ ID NO：3)

P2：5’-ATGAAGCAAGCATCGAAAG-3’(SEQ ID NO：4)

以环化DNA作为模板，以P1，P2作为引物进行反向PCR扩增，对扩增产物进行嵌套PCR，嵌套PCR扩增引物为：

P3：GATTCTAGCCATGACAGC(SEQ ID NO：5)

P4：TGTTGGAGGTGTCGTGCTT(SEQ ID NO：6)

回收扩增产物，连接到pMD19-T载体上，转化大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒，测序，与已知片段重复序列拼接。以此片段再次设计反向PCR引物，引物序列为：

P5：CATGGGAGACTTAGACGTGG(SEQ ID NO：7)

P6：CTCGAAGTGGAGCTATCCGC(SEQ ID NO：8)

进行反向PCR扩增，回收扩增产物，连接到pMD19-T载体上，转化大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒，测序，将测序结果的重叠区拼接，获得了长度为3249bp的DNA片段。比对分析结果表明该序列包括PHK4基因完整3’端。

3、染色体步移

在3249bp片段的5’端设计三条特异性嵌套引物，引物序列为：

P-SP1：TTTGGAAGCGGCGGTTATGTCT(SEQ ID NO：9)