[发明专利]农杆菌介导小麦遗传转化体系的完善及转基因研究

说明书

技术领域

农杆菌介导小麦遗传转化体系的完善及转基因研究，属于植物基因工程技术领域。

背景技术

小麦是禾本科(Gramineae)小麦属(Triticum)一年生或多年生草本植物，是世界上重要的粮食作物之一。利用植物基因工程技术进行小麦遗传改良，以提高小麦产量、改善品质、增强抗病虫和抗逆能力，是小麦遗传育种的一个新的方向。

自1983年获得第一株转基因作物以来，作物转基因技术得到了迅猛发展，转基因作物育种已成为常规育种的有效补充。目前，几乎所有的作物都开展了转基因研究，育种目标涉及到高产、优质、高效、兼抗性及多用途等诸多方面，一批抗逆性(如抗病、抗虫、抗除草剂)转基因作物已进入商品化生产阶段。由于受到转基因技术的限制，小麦转基因研究滞后于其它作物，直到1992年Vasil等将GUS/Bar基因导入小麦品种Pavon，并获得了抗除草剂Basta的再生植株，才宣告世界上首例转基因小麦问世。在国内，小麦遗传转化发展也很迅速，Cheng等在1997年成功获得可育的转基因植株，1999年Xia等在中国首次报道获得了稳定胚性组织的转基因小麦植株。实验的成功，表明小麦育种已经从传统的育种方法过度到了“分子育种”的阶段。

近年来对转基因小麦的研究发展很快，并取得了一定的成就，但与双子叶植物相比，甚至与其他禾谷类作物(如水稻和玉米)相比，仍然存在较大的差距(肖兴国等，2000)。目前，小麦转基因技术仍处于建立和优化阶段。这主要是由以下几个方面的原因造成的：第一、缺乏有效的离体再生体系。小麦组织培养中植株再生率低和基因型依赖性强的问题一直是限制转基因成功及大幅度提高转基因小麦数量的主要因素；第二、用于基因转化的外植体材料比较少。幼胚是进行小麦遗传转化的主要外植体，但往往受到取材季节的限制；第三、过分依赖基因枪法。目前转基因小麦90％以上是用基因枪法获得的，而基因枪法则存在许多缺点，限制了小麦转基因的发展；第四、对农杆菌转化单子叶植物特别是转化小麦的机理缺乏系统和深入的研究；第五、小麦本身是异源六倍体，其基因组较大并且复杂，导入的外源基因沉默与修饰现象很严重。

尽管以上许多因素延缓了小麦转基因技术的发展，但是随着多种转基因体系的建立，小麦转基因研究的发展速度将会加快。研究方向将会由以基因枪法为主而逐渐转向以农杆菌介导法为主，同时各种辅助农杆菌介导的技术也将走向成熟，这将有助于优化和完善农杆菌介导的小麦转基因技术体系。

发明内容

1、小麦遗传转化的主要方法：

基因枪转化是小麦遗传转化中最常用的方法，其转化体系已基本建立。农杆菌介导的小麦遗传转化获得了突破，并将以其诸多优点替代基因枪转化而成为今后研究的热点。花粉管通道转化取得了实用性成果，以其简便易行被更多的育种家所接受。

(1)基因枪法

基因枪转化是将外源基因在Ca²⁺或亚精胺等作用下吸附在重金属金或钨粒子表面(直径1μm左右)，制成DNA微弹，利用基因枪将微弹高速射入植物受体细胞，释放出的DNA分子随机整合到植物基因组中，然后通过细胞和组织培养技术，再生出植株，从而实现遗传转化。

现在基因枪法的转化体系已相对比较成熟，早在1995年就提出了完整的转化体系。因此由基因枪介导的小麦遗传转化作为改良小麦性状、提高小麦抗性的主要手段之一被广为应用。在国内，张晓东等人用基因枪法将除草剂抗性基因与小麦1Dx5和1Dy10亚基克隆重组质粒导入到小麦幼胚和幼穗中，获得转基因植株。梁静静等利用基因枪法将重组质粒pCAMBIA1301-Sub5+10导入小麦幼胚，获得了经PCR检测证明的转基因植株，Rooke等获得了1Dx5亚基超量表达的小麦品系(约为自然表达量的4倍)。

影响基因枪介导小麦遗传转化效率的因素有很多，比如：受体材料的类型、生理状态、接受和整合外源DNA的能力、金粒制备和轰击参数(如微弹速度、射程、金粉用量、轰击次数、真空度、质粒DNA用量)等。虽然不同材料有所差异，但轰击时的金粒用量应该在细胞承受损伤的范围之内，并且保证达到有效轰击。另有些研究表明，受体材料轰击前的预培养也可以提高基因枪转化效率。