[发明专利]DcR3和GAD65双基因共表达重组腺病毒及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组腺病毒，特别涉及一种DcR3和GAD65双基因共表达重组腺病毒，还涉及该重组腺病毒的制备方法和应用。

背景技术

随着人民生活水平的提高以及生活方式的改变，糖尿病的发病率日益增加，已成为继心血管疾病和肿瘤之后影响群众健康和生命的第三大疾病。胰岛移植具有简便、安全、有效的特点，术后患者不需要依赖外源胰岛素即能纠正体内糖代谢紊乱，明显提高生活质量，在糖尿病特别是1型糖尿病的治疗中备受瞩目。但是，由于供受体的遗传背景差异，胰岛移植容易受到宿主的免疫排斥以致发生移植后并发症，从而影响治疗效果。而诱导特异性T细胞耐受对胰岛移植排斥是一种很有希望的治疗策略。

迄今报告的胰岛候选自身抗原已逾20种，其中谷氨酸脱羧酶65(glutamic acid decarboxylase 65，GAD65)被认为是最重要的自身抗原，并极有可能是1型糖尿病的始动靶抗原，在早期的1型糖尿病患者中有大量GAD65特异性T细胞存在。因此，可以利用GAD65诱导特异性T细胞耐受以避免胰岛移植排斥。诱骗受体(decoy receptor)是指那些细胞膜外区与功能性受体细胞外区结构相似，能结合配体，但细胞质区缺乏转导信号能力的受体。诱骗受体通过与功能性受体竞争性结合相同的配体，从而在受体水平对细胞活性和分化以及免疫功能发挥调控作用。诱骗受体3(decoy receptor，DcR3)是新近发现的肿瘤坏死因子受体超家族成员，具有调节细胞凋亡和免疫细胞活性及分化的生物学特性，在肿瘤免疫、自身免疫、移植免疫及抗感染免疫中发挥着重要作用。转基因非肥胖型糖尿病大鼠模型实验证明，DcR3能阻止自身免疫细胞及环磷酰胺对胰岛β细胞的自身免疫性损伤，防止糖尿病的发生，还能明显减轻胰岛炎性反应。此外，动物移植模型实验证明，DcR3转基因胰岛细胞移植成功率明显高于野生型胰岛细胞。

基因联合治疗的方式主要有两种：一是将多种分别携带不同基因的重组表达载体同时转染靶细胞，这种方式可以自由调节各重组表达载体的比例，但需要分别构建携带不同基因的重组表达载体，构建工作繁琐、费时，影响因素多；此外，由于转染过程具有一定随机性，转染后的细胞存在基因拷贝不均一的问题，既不利于目的基因的表达及后续治疗，又导致实验结果难于评估分析；上述缺点限制了此种方式的进一步应用。二是将两个或两个以上的基因由一个载体携带表达，这种方式可以通过多启动子载体、多顺反子载体或融合基因等调控手段提高基因转染效率，增加表达强度，并维持相对的表达比例，从而克服了前一种方式的不足，近年来日益受到研究者的重视。

树突状细胞不仅是机体内功能最强大的抗原递呈细胞，可以有效激活初始T细胞启动免疫应答反应，而且树突状细胞本身具有调节免疫反应、诱导免疫耐受的作用。体外构建携带免疫抑制分子基因的重组病毒并转染树突状细胞制成树突状细胞疫苗，再将其回输体内，已广泛应用于诱导免疫耐受等方面的治疗。

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种DcR3和GAD65双基因共表达重组腺病毒，能够诱导特异性T细胞耐受，有效抑制胰岛β细胞的破坏，并延长移植胰岛的生存期；目的之二在于提供所述DcR3和GAD65双基因共表达重组腺病毒的制备方法；目的之三在于提供所述DcR3和GAD65双基因共表达重组腺病毒的应用。

发明内容

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

1、DcR3和GAD65双基因共表达重组腺病毒，所述重组腺病毒基因组中包含一个DcR3和GAD65双基因表达盒，所述DcR3和GAD65双基因表达盒由上游至下游依次包含CMV启动子、DcR3全长编码基因、终止子、内部核糖体进入位点IRES、GAD65全长编码基因和终止子。

2、所述DcR3和GAD65双基因共表达重组腺病毒的制备方法，包括以下步骤：

a、RT-PCR扩增DcR3全长cDNA；

b、RT-PCR扩增GAD65全长cDNA；

c、将步骤a所得DcR3全长cDNA插入pStar载体的IRES上游，步骤b所得GAD65全长cDNA插入pStar载体的IRES下游，得重组载体pStar-DcR3-IRES-GAD65；

d、以步骤c所得重组载体pStar-DcR3-IRES-GAD65为模板，PCR扩增DcR3-IRES-GAD65片段并更换该片段两端的酶切位点；