[发明专利]包含硫酯酶功能域的腊梅基因及其抗旱基因工程应用

说明书

技术领域

本发明属分子生物学与基因工程领域，具体涉及含硫酯酶功能域的腊梅基因克隆及其应用。

背景技术

在植物体中，质体的脂肪酸合成包括原核途径与真核途径。质体中的脂肪酸从头合成能被质体酰基转移酶终止，将酰基基团从acyl-ACP转至质体的甘油脂类中，这为原核途径；或者被acyl-ACP硫酯酶，将acyl-ACP水解，释放游离脂肪酸和ACP，然后将脂肪酸输出质体，被辅酶A重新酯化送到辅酶A池中。作为内质网甘油脂类的源出，这是真核途径。硫酯酶属酯酶家族酯酶，是水解酶的一种。可以将acyl-ACP水解，释放游离脂肪酸和ACP。

脂肪酸的生物合成主要发生在质体的基质中，由乙酰辅酶A经一系列反应，生成不同链长(C8～C18)的脂肪酰ACP。在质体中发生的最后一步反应，是硫酯酶将游离的脂肪酸从ACP上释放出来，所以在脂肪酸从头合成中，acyl-ACP硫酯酶对于碳链的终止扮演重要角色。

根据氨基酸的序列比较和酶底物的特异性不同，植物中分为两种基本类型的酰基-ACP硫酯酶。一类命名为FatA，对于18:1^Δ9-ACP活性最高，所以推测FatA决定着植物体内18:1输出到质体外的水平。第二类以16:0-ACP硫酯酶为代表，对较短链的饱和酰基-ACP活性最高。FatB对底物的催化活性为16:0-ACP＞18:1^Δ9-ACP＞18:0-ACP＞14:0-ACP。因为酰基ACP硫酯酶具有底物特异性，所以它的活性影响着各种甘油脂类中脂肪酸成分之间的比率，是决定脂肪酸的链长和饱和脂肪酸水平的主要因素。

最近研究发现FatB基因在植物体内是古老的，存在植物的各器官中，在花中表达量最高。推测FatA和FatB支系的分离比樟树植物的分离更早，估计分离约在1.5-3.0亿年前，FatA是由FatB衍生的。中链的硫酯酶是在被子植物进化过程中，由16:0硫酯酶经过几次进化过程演变而来的。

硫酯酶具有酰基转移酶的功能域，可以将酰基从酰基-酰基载体蛋白上分离出来。

脂酰-ACP硫酯酶催化FAS循环的终止，已从多种植物中纯化，编码基因也已从红花、油菜和拟南芥菜等多种植物中克隆。不同的脂酰-ACP需要不同的酶，如红花中克隆的硫酯酶对油酰-ACP特异，而拟南芥中克隆的硫酯酶对14～18碳饱和底物具特异性。

酰基ACP硫酯酶成为脂类生物合成酶系中第一个经改造，并转入转基因植物以产生经济产品的酶。生物技术公司Calgene的工作首先证明了存在中链酰基ACP硫酯酶，并提供了生化证据。然后从加州月桂中克隆了12:0-ACP硫酯酶。将编码单个中链酰基ACP硫酯酶的基因转入植物可以明显改变种子油中所储存的脂肪酸的长度。除了月桂中的特异于月桂酸的酰基ACP硫酯酶以外，特异于其他链长的硫酯酶也已从不同植物中鉴定出来了。其他生产富含别种中链脂肪酸，如豆蔻酸和葵酸的转基因植物也已得到。

在研究拟南芥突变体(Fatb-ko)时，发现突变体的生长速率低于野生型拟南芥，生长4周以后，突变体鲜重与野生型植物相比较减少50％。而且突变体的种子发育能力低，形态学发生改变。在突变体中，在不同的组织中，饱和脂肪酸总的数量比野生型减少40％-50％，这种减少仅发生在细胞溶质中的脂肪酸组分、叶和茎表面的蜡层、种子中的三酰基甘油中，而且发现突变体在植株生长和种子萌发都受到影响。

腊梅是一种众所周知的多抗植物，其所具有的极强的抗低温、抗干旱、抗病虫能力，这与腊梅的叶片表面含有大量的蜡质层有关，而蜡质层是由长链脂肪酸构成。在众多的研究中，还没有看到有关含硫酯酶功能域的腊梅基因在植物的抗逆生理功能方面的相关报道。

发明内容

(1)提供一种DNA序列，其编码一种含硫酯酶功能域的腊梅基因，命名为CpAcylTase；(2)提供一种利用基因工程方法得到CpAcylTase编码的蛋白；(3)提供CpAcylTase基因在植物抗旱方面的应用。

本发明提供了CpAcylTase基因，它具有如序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。