[发明专利]红掌漆酶基因的克隆及表达载体构建

说明书

技术领域

本发明涉及红掌中漆酶基因Laccase的克隆、重组及对种皮颜色控制功能的分析和应用，属于分子生物学和生物技术领域。

背景技术

漆酶是最简单的多铜氧化酶，一般含有4个铜原子，分布于3个高度保守的不同结合位点，每个铜原子在催化机制中都有很重要的作用。漆酶能催化O₂，通过4个电子还原成水，并且伴随着一些酚类底物的氧化。漆酶蛋白一般由500～550个氨基酸构成，有N端分泌信号肽。关于漆酶空间结构的详细资料来自于漆酶的晶体衍射研究。Valerie Ducros等人从Corpprinuscinereus中得到该酶的结晶，并分析了同一晶体2.2A分辨率条件下的X-ray图谱，发现单个酶分子由3个环状结构域组成，三者紧密连接在一起，形成球状结构。

根据光谱学、动力学对漆酶晶体衍射原理进行研究，得出漆酶催化底物的方式可能是：底物结合于酶活性中心的I型铜原子位点，通过Cys-His途径将其电子传递给三核位点，该位点进一步把电子传递给结合到活性中心的第二底物氧分子，使之还原为水。同时，底物形成自由基，它们可以自身结合或相互偶联，形成聚合物或偶联产物。漆酶是单电子氧化还原酶，在小分子的介体物质存在下，漆酶可氧化非酶底物。目前通过不断研究，发现漆酶可氧化的非酶底物范围还在不断增加，这一性质预示着漆酶具有广泛的应用前景。不同漆酶氧化能力不一样，氧化方式也不同，甚至完全相反。漆酶氧化速率的大小不仅与漆酶本身的稳定性有关，而且也与漆酶和底物作用的一些动力学参数有关。

种皮的显棕色是由于黄酮类的氧化，尤其是原花青素，它是一种黄烷-3-醇亚单位，例如表儿茶素和儿茶素的多聚体。

在红掌突变体的种子里，积累了更多的表儿茶素单体和比野生型更多的可溶性原花青素。而且，红掌的完整的外种皮细胞中，在表儿茶素和儿茶素存在的情况下，不能触发独立的H₂O₂非依赖性显棕色。与野生型作对照，通过紫外线检测和质谱技术，发现单独由表儿茶素获得的主要氧化产物是黄色的二聚体，称为脱氢双表儿茶素A(dehydrodiepicatechin A)。这种产物与原花青素在属性和黄烷亚单位的连接位置不同。红掌突变体种子中的黄酮醇含量也受到影响，其槲皮素鼠李糖苷单体与二聚体的比值也远高于野生型种子。

漆酶基因编码一种与类似漆酶的多酚氧化酶极为类似的蛋白，它主要在种皮的发育过程中表达，此处含有黄酮类的末端产物---原花青素与黄酮醇。此基因涉及黄酮类的氧化聚合并作为一种漆酶类型的黄酮类氧化，尤其是原花青素。

发明内容

本发明的目的是提供一种红掌漆酶基因的克隆及表达载体构建。

本发明首次从红掌中分离出漆酶基因的全长cDNA。

一、红掌漆酶基因全长cDNA序列的分离

(1)漆酶基因中间片段的获得

以红掌“阿拉巴马”野生型与其绿色突变体为材料，利用CTAB法提取总RNA，各取2微克总RNA，利用StraightA’s mRNA Isolation System分离纯化mRNA，使用CloneTech公司PCR-Select subtraction试剂盒，做差减抑制杂交(SSH)，在野生型特异表达的差减库中获得278bp的特异序列：

1   ACATGGAGGC ATGTAAGAAG GTGGAGGCAG AATTTGAGCT TCAGAACTAT

51  TCCCATTCTC CACAATGAAG ACGGTTGCCA TGCCCCAGCT CGTATGGCGT

101 TCAAAGTGGC AGTGCATAAA CCACACACCT GGGTTGTCGG CTCTGAATCT

151 GATGGCCGCC CAGCCATTCC TGGGGACCCC AAACGTGTTC  ATCAATGGAG

201 GGTCCACGAG GTTGTAGTTT TCAGGGTCCT TGGTCCTGTT GAAGTTGCCG

251 GGGCCGACGC CCACCCGGTA GAAGCTGT

(2)漆酶基因全长cDNA序列的分离

根据中间片段，设计3′和5′末端快速扩增(RACE)引物：

5′RACE引物：5’gCT CgT ATg gCg TTC AAA gTg gCA gT 3’

3′RACE引物：5’AAg gAC CCT gAA AAC TAC AAC CTC gTg gA 3’