[发明专利]一种大肠杆菌重组鸡α-γ二价干扰素及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种大肠杆菌重组鸡α-γ二价干扰素及其制备方法。

背景技术

当前家禽肿瘤病和病毒病感染引起的鸡马立克氏病、新城疫、传染性法氏囊病、传染性支气管炎、传染性喉气管炎、脑脊髓炎、流感、传染性贫血、病毒性肝炎等病毒病给养禽业带来巨大的经济损失，今年来已经成为危害鸡业最为严重的疾病之一。对家禽肿瘤病和病毒病的有效治疗一直是困扰禽病防治的重大难题之一。鸡的免疫系统以及在病原感染或注射疫苗时所产生的免疫反应与PURU动物相似，所以可以考虑应用细胞因子来控制疾病。相对来说，禽类的饲养简单、廉价，出笼时间短，而且数量较大，这就需要考虑所用疫苗或者治疗药物的经济价值。绿色食品工程的启动，人们对食品安全的重视的升温，常用抗病毒药物带来的严重的药物残留危及人类的健康，这些问题得到社会的普遍关注。所以，养禽业迫切需要新一代的天然治疗方法。在病原感染和疫苗免疫中，干扰素等细胞因子可调控免疫反应的类型与反应强度，是一种高效的、天然的治疗方法。而按照传统方法进行治疗，很难在短时间内控制病情，而使用基因工程干扰素则可以使机体迅速的抗病毒增殖，抗肿瘤增生，并能提高免疫力。在临床上应用，不但效果明显，而且无药物残留，能在病毒性感染的早期对其进行有效的治疗。利用生物技术手段研制开发畜禽用干扰素(IFN)是在化学药物禁用后抵抗畜禽疫病有力武器，IFN具有广谱的抗病毒作用，表现在毒增殖量减少，细胞损伤程度降低，同时具有提高机体免疫力的双重作用。可用于防治鸡新城疫、禽流感、法氏囊病。本发明选择干扰素的基因工程表达产物开发出绿色高效抗感染生物制剂，实现基因工程表达干扰素产品产业化。

本发明涉及的一种重组鸡α-γ二价干扰素具有抗病毒和免疫调节的双重功效，未见临床联合应用的报道。

发明内容

1、根据GenBank中鸡IFN-α基因设计引物对，利用PCR技术克隆，在成熟肽基因两侧设计一对引物，分别加入合适的酶切位点，将其亚克隆在表达载体PET上，转化BL21(DE3)后用IPTG诱导表达，用SDS-PAGE电泳分析表达形式，结果为蛋白以包涵体形式表达，破碎菌体提取包涵体纯化后，利用半胱胺酸-半胱胺酸再氧化法对纯化后的包涵体变性液进行分段稀释法复性。通过细胞病变抑制法测定复性液体的抗病毒活性，得到鸡α-干扰素。

2、根据GenBank中鸡IFN-γ基因序列，去掉信号肽区，对其成熟肽区进行大肠杆菌密码子偏好性改造和mRNAde 5’端耳机结构进行分析，在序列两端同时设立BgI II与Hand III酶切位点，进行合成和TA克隆测序验证。再经过表达载体的构建、重组表达载体的转化、诱导表达，在经过电泳后确定表达形式，通过镍柱纯化目的蛋白并抗病毒活性检测，最后得到了鸡γ-干扰素。

3、通过基因设计与合成，表达子载体的构建、诱导表达、目的蛋白纯化及获得活性物质而制成。将鸡α-干扰素和鸡γ-干扰素成熟基因克隆至PET载体上，转化至宿主菌BL21(DE3)中，经IPTG诱导表达，得到了目的蛋白，经过水泡性口炎病毒-鸡胚成纤维细胞系统测定具有很高的抗病毒活性。

本发明的优点在于利用大肠杆菌表达鸡α-干扰素，以包涵体形式表达，通过变性复性后具有广谱的抗病毒作用，而大肠杆菌表达鸡γ-干扰素分泌表达，通过纯化蛋白后具有免疫调节活性和一定的抗病毒活性，二者联合应用具有明显的协同作用，本发明所得二价干扰素可优于单独应用任何一种干扰素对新城疫和法氏囊的治疗和预防。

具体实施方式

根据GenBank中鸡IFN-α基因设计引物对，利用PCR技术克隆IFN-α基因，在成熟肽基因两侧设计一对引物，分别加入合适的酶切位点，将其亚克隆在表达载体PET上，转化BL21(DE3)后用IPTG诱导表达，用SDS-PAGE电泳分析表达形式，结果为蛋白以包涵体形式表达，破碎菌体提取包涵体纯化后，利用半胱胺酸-半胱胺酸再氧化法对纯化后的包涵体变性液进行分段稀释法复性。通过细胞病变抑制法测定复性液体的抗病毒活性，得到鸡α-干扰素。再根据GenBank中鸡IFN-γ基因序列，去掉信号肽区，对其成熟肽区进行大肠杆菌密码子偏好性改造和mRNAde 5’端耳机结构进行分析，在序列两端同时设立BgI II与Hand III酶切位点，进行合成和TA克隆测序验证。再经过表达载体的构建、重组表达载体的转化、诱导表达，在经过电泳后确定表达形式，通过镍柱纯化目的蛋白并抗病毒活性检测，最后得到了鸡α-γ干扰素。