[发明专利]一种发酵木糖生产乙醇的重组酵母的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种重组酵母的构建方法。

背景技术

随着经济增长所引起的对能源的巨大需求和化石等常规燃料的 日益枯竭，加快了人们寻找开发新能源的步伐。乙醇作为一种可再生 的清洁能源被认为是最具潜力和发展前景的能源之一。传统的以粮食 为原料发酵生产乙醇的方法，成本高，污染重，产率低，造成了资源 的严重浪费，受到了一定的限制。

以各类农林废弃物为代表的植物纤维素等是地球上最丰富的生 物质资源。纤维素、半纤维素是植物纤维的主要成分，质量分数可达 50％～70％，是重要的可再生资源，其中半纤维素的主要水解产物是 木糖，若以其为原料生产燃料乙醇，不仅可以解决当前以粮食等为原 料生产燃料乙醇的诸多问题，而且还可以促进农村的经济发展和减少 因焚烧产生的环境污染等问题。

自然界中发酵木糖的酵母菌有树干毕赤酵母(Pichia stipitis)、 休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)、嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)以及黏红酵母(Rhodotorula glutinis)等，但它们对乙醇 的耐受能力较差，发酵液中乙醇浓度低，不适合乙醇的工业化生产。 酿酒酵母是乙醇发酵的优良菌株，但它缺乏木糖代谢途径，不能代谢 木糖产乙醇。

利用基因工程技术构建重组细菌或酵母发酵木糖生产乙醇，现已 有报道，但构建的重组菌株具有以下缺点：1.在构建过程中所涉及的 步骤多，且方法繁琐；2.重组微生物所获得的与木糖代谢有关的代 谢途径不稳定。

微生物原生质体融合技术又称细胞融合技术，是微生物育种中一 种重要的方法，它是指通过酶法去除两种不同亲株的细胞壁后，得到 原生质体，再置于高渗溶液中，在一定融合剂的促融或电击融合等的 作用下使两者相互凝集并发生细胞之间的融合，进而导致基因或染色 体重组，获得新菌株的育种方法。原生质体融合方法主要有：硝酸钠、 高钙高pH、PEG法、电击法等。然而，到目前为止还没有关于采用 原生质体融合法构建发酵木糖产乙醇的重组酵母的报道。

发明内容

本发明针对上述不足提供一种构建发酵木糖生产乙醇的重组酵 母的方法，以及该方法构建得到的重组酵母及应用。

本发明发酵木糖生产乙醇的重组酵母的构建方法，是采用原生质 体融合法将能够代谢木糖的酵母与酿酒酵母融合，筛选出能够代谢木 糖且乙醇产率较高的重组酵母。

所述能够代谢木糖的酵母包括但不限于：黏红酵母(Rhodotorula glutinis)、圆红冬孢酵母菌(Rhodosporidium toruloides)，乳酒假丝 酵母(Candida kefyr)，扣囊复膜孢酵母(Saccharomycopsis fibuligera)。 优选为黏红酵母(Rhodotorula glutinis)。

具体而言，本发明方法可包括如下步骤：

1)酿酒酵母URA3营养缺陷型突变株的获得

通过亚硝基胍(NTG)化学诱变，在制霉菌素及含有5-FOA(5- 氟乳清酸)、尿苷及尿嘧啶的YNB(不含氨基酸的氮源)固体培养基 上筛选酿酒酵母URA3缺陷型突变株；

2)通过高渗溶液以及蜗牛酶分别处理酿酒酵母及黏红酵母细胞， 经离心去酶，重悬于稳渗剂中制备原生质体；

3)通过PEG融合方法制备融合细胞，并在营养缺陷型的培养基 上筛选能够生长的菌株；

4)将筛选到的融合细胞在仅以2％木糖为唯一碳源的YP(Y： yeast extract P：peptone)平板培养基上再次筛选，同时逐步提高培养 基中木糖的浓度，不断进行传代培养及发酵优化，剔除、筛选出相对 生产乙醇较高的重组酵母。

上述步骤中为了筛选采用了酿酒酵母URA3营养缺陷型，然而本 领域技术人员还可以按照此类方法使用诸如各种氨基酸营养缺陷型、 各种核酸营养缺陷型以及各种维生素营养缺陷型等等，利用相应的培 养平板进行筛选。

利用通过上述方法构建得到的重组酵母，进行葡萄糖、木糖共发 酵：按2％的量接种重组酵母，在28～30℃，pH5.0～6.5条件下发酵， 组分为：5％木糖+2％蛋白胨+1％酵母膏+10％葡萄糖，并分别测定发 酵液中葡萄糖和木糖的消耗量及乙醇的产量。结果，融合细胞能够在 上述条件下发酵木糖产乙醇。