[发明专利]一种角质酶的突变体及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种酶突变体及其制备方法，尤其涉及角质酶的突变体及其制备方法，本发明属于基因工程和酶工程领域，具体地说本发明是利用蛋白质工程的定点突变方法改善耐热角质酶的底物特异性的技术。

背景技术

角质酶是能够水解角质大分子的水解酶。作为一种多功能酶，在纺织工业、食品工业以及化工工业等诸多领域都有着广泛的应用。尤其在纺织工业中，角质酶可用于棉纤维生物精练，以去除棉纤维表面蜡质和角质，并有助于果胶、蛋白质等杂质的进一步去除，从而达到精练目的。近年来研究表明，角质酶还可用于合成纤维聚对苯二甲酸乙二酯(PET)的改性，增加织物吸水性，改善手感，提高织物品质。上述两工艺目前均采用传统碱处理工艺，存在水耗、能耗大，排放废水碱性强、色度深、COD值高以及对纤维损伤大等弊病。酶精练工艺作为一种节能降耗、环境友好的纺织品清洁生产技术，已成为国内外染整行业发展的新趋势。

国外对角质酶进行了大量的研究，主要集中于Fusarium solani等真菌来源角质酶。但真菌角质酶热稳定性差，不适合在纺织工业中的应用。而本实验室开发的嗜热放线菌(Thermobifida fusca)产耐热角质酶可有效水解角质、PET等聚酯，但水解效率较低(陈坚，吴敬，陈晟.一种耐热角质酶及其编码基因和表达.申请号200710026074.2)。因此通过结构模拟确定突变位点，通过定点突变技术提高耐热角质酶对角质和PET的催化效率极为重要，具有较强的工业应用价值。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题是提供一种角质酶的突变体，包括一个或两个相应于嗜热放线菌(Thermobifida fusca)的角质酶活性中心位点附近的氨基酸残基的取代，与亲代角质酶相比具有更强的角质或PET水解能力。

所述嗜热放线菌(Thermobifida fusca)产角质酶的基因与NCBI数据库中Thermobifidafusca编码的蛋白Tfu_0883极其类似，基因全长906个核苷酸，编码301个氨基酸，和蛋白Tfu_0883的基因有两个核苷酸的差异，编码氨基酸相同(陈坚，吴敬，陈晟.一种耐热角质酶及其编码基因和表达.申请号200710026074.2)。

所述角质酶突变体是218位氨基酸异亮氨酸Ile突变为丙氨酸Ala，命名为I218A。

所述角质酶突变体是是第132位氨基酸谷氨酰胺Gln和第101位氨基酸苏氨酸Thr同时突变为丙氨酸Ala，命名为Q132A/T101A。

所述角质酶突变体是是第195位氨基酸色氨酸Trp和第249位氨基酸苯丙氨酸Phe同时突变为丙氨酸Ala，命名为W195A/F249A。

本发明的所要解决的另一个技术问题是提供上述突变体的制备方法。

为解决上述问题，本发明的技术方案是：在嗜热放线菌(Thermobifida fusca)角质酶模拟结构的基础上确定突变位点；设计定点突变的突变引物，以携带角质酶基因的载体为模板进行定点突变构建突变质粒I218A-pet20b(+)、W195/F249-pet20b(+)、Q132A/T101A-pet20b(+)；将突变质粒转化转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞，挑选验证后的阳性单克隆进行发酵培养，25℃恒温培养至80h，对上清液进行硫酸铵沉淀、离子交换柱纯化角质酶突变体I218A、Q132A/T101A和W195A/F249A。

所述携带角质酶的载体为pUC系列，pET系列，活pGEX中的任一一种。

本发明的有益效果：本发明提供了一组具有纤维高催化效率的角质酶突变体及其制备方法，I218A、Q132A/T101A和W195A/F249A对棉纤维的催化效率均有所提高，其中突变体I218A对角质的催化效率比原角质酶提高50％；Q132A/T101A对合成纤维对苯二甲酸乙二酯(PET)的催化效率比原角质酶提高3倍。这三种突变体在纺织工业中有重要的应用价值。

附图说明

图1嗜热放线菌(Thermobifida fusca)角质酶突变体纯化SDS-PAGE电泳图。

泳道1：标准分子量蛋白；

泳道2：I218A发酵液；

泳道3：I218A纯化制品；

泳道4：W195A/F249A发酵液；

泳道5：W195A/F249A纯化制品；

泳道6：Q132A/T101A发酵液；

泳道7：Q132A/T101A纯化制品。

图2嗜热放线菌(Thermobifida fusca)角质酶突变体角质水解活力分析。