[发明专利]一种感染核果类果树的苹果花叶病毒的分子检测方法

权利要求书

1.一种感染核果类果树的苹果花叶病毒的分子检测方法，包括下列步骤：

(1)从样品中提取RNA；

(2)以步骤(1)获得的RNA为模板进行反转录-PCR反应，其中正向引物APMVF(5’-3’)为：GTGAGGAAGTTTAGGTTGGTTTTGG，反向引物为APMVR(5’-3’)：CCTAATCGGGGCATCAATTTCTTTC；

(3)特异性PCR扩增反应：以步骤(2)获得的反转录-PCR反应产物为模板，引物是所述的APMVF和APMVR，进行特异性PCR扩增反应；

(4)对特异性PCR扩增反应产物进行电泳检测，若在414BP处有目的条带，则确定该样品被APMV苹果花叶病毒感染。

2.根据权利要求1所述的分子检测方法，其特征在于步骤(2)所述反转录-PCR反应的步骤为：

(a)加入步骤(1)获得的RNA0.1～5μg，引物APMVF和APMVR各15～20pmol用体积浓度为0.1％的DEPC的双蒸水溶液加至总体积达11μL，70℃下反应5min；

(b)加入4μL的5×reaction buffer，2μL浓度为10mM的DNTP，再加入20U的RNA酶抑制剂，用体积浓度为0.1％的DEPC的双蒸水溶液加至总体积达19μL，37℃下反应5min；

(c)加入200U的M MuLV反转录酶，42℃下反应60min，然后70℃下反应10min。

3.根据权利要求1或2所述的分子检测方法，其特征在于步骤(3)所述特异性PCR扩增反应体系为：5μL的10×Taq buffer，1μL浓度为10mM的DNTP，引物APMVF和APMVR各0.5～1μM，Taq DNA Polymerase 1.25U，3μL浓度为25mM的MgCl₂，模板10pg～1μg，双蒸水将反应体系补充到50μL。

4.根据权利要求3所述的分子检测方法，其特征在于步骤(3)所述特异性PCR扩增反应条件为：95℃变性2min；94℃变性30sec，43℃退火30sec，72℃延伸30sec，72℃最后延伸10min，35个循环。