[发明专利]mRNA二级结构优化提高(R)-羰基还原酶的生物转化效率的方法

说明书

技术领域

mRNA二级结构优化提高(R)-羰基还原酶的生物转化效率的方法，通过优化mRNA翻译起始区的二级结构，克服蛋白翻译启动的空间位阻，促进目标蛋白的高效表达及其空间结构的正确折叠，有效提高酶蛋白活力及生物催化功能的方法与应用，属于生物催化不对称转化技术领域。

背景技术

手性醇具有特殊的光电磁性能和生理活性，是非常理想的手性药物中间体和液晶材料掺加剂。特别是光学纯苯基乙二醇，更是医药、农药和化工材料中一种重要的手性模块化合物。利用重组氧化还原酶不对称还原潜手性酮制备光学手性醇，已成为当今工业上生产手性醇的主要发展趋势。

mRNA翻译起始区二级结构的稳定性与靶蛋白翻译的起始进程密切相关。据统计，mRNA翻译起始区二级结构内吉布斯自由能(ΔG)绝对值每增加1.4kcal/mol，翻译起始效率将降低10倍。

近平滑假丝酵母细胞催化混旋的苯基乙二醇，可获得光学活性的(S)-苯基乙二醇，参与反应的关键酶有两种，即(R)-羰基还原酶和(S)-羰基还原酶。前者催化(R)-苯基乙二醇与2-羟基苯乙酮之间的可逆反应；后者以中间体2-羟基苯乙酮为底物，产生(S)-苯基乙二醇；由于(R)-羰基还原酶的表达水平和催化效率远远低于(S)-羰基还原酶，导致近平滑假丝酵母只能合成(S)-苯基乙二醇。在此研究基础上，本实验室以mRNA翻译起始区中的+1～+78区作为优化对象，对多个核苷酸实施定点突变，构建相应的优化突变体，实现了(R)-羰基还原酶的高效表达，提高了酶活力和生物转化效率，为高效制备光学活性的(R)-苯基乙二醇提供了崭新途径。

发明内容

1、要解决的技术问题。本发明的目的是提供一种mRNA翻译起始区二级结构优化技术改善酶的表达水平和催化功能，利用重组菌株(菌种保藏号：CCTCCNO：M 209289)高效不对称转化制备(R)-苯基乙二醇的方法。本发明目的在于通过对(R)-羰基还原酶mRNA翻译起始区的二级结构中的14个核苷酸位点实施同义突变，使酶蛋白表达水平提高了4～5倍，酶活力提高61.9％，对高浓度(5.0g/L)底物2-羟基苯乙酮进行催化反应，产物(R)-苯基乙二醇的光学纯度和产率分别达到95.2％e.e.和83.3％，比优化前提高了30.4％和43.1％。为高效制备具有光学活性的(R)-苯基乙二醇提供了新型研究思路和借鉴意义。

2、技术方案：

(1)、一株不对称转化制备(R)-苯基乙二醇的重组菌，其分类命名为大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pET32a-mrcr，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M209289。

(2)、所述重组菌CCTCC NO：M209289的构建方法，将突变基因mrcr插入载体pET32a构建重组质粒pET32a-mrcr，重组质粒pET32a-mrcr转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，通过含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板筛选，获得重组菌株E.coli BL21/pET32a-mrcr，即CCTCC NO：M209289；步骤为：

①基因的优化：根据MFOLD软件算法，对(R)-羰基还原酶编码基因rcr的mRNA翻译起始区中部分核苷酸(+1nt～+78nt)进行分析，以降低二级结构的稳定性或自由能ΔG为依据，对13个核苷酸进行了定点突变；由A：(+1) atgtca att cca tca agc cag tac gga ttc gta ttc aat aag caa tca gga ctt aag ttg aga aat gat ttgcct gt

②mrcr的获得：以重组质粒pETRCR作为PCR反应模板，利用含有NcoI限制性酶切位点的引物mRCR_F，含有XhoI限制性酶切位点的引物mRCR_R，通过PCR扩增反应，获得mrcr基因，其全长为1008bp；

mRCR_F：5’

-GACCATGGGATCAATACCATCATCACAATACGGATTCGTATTCAATAAGCAATCAGGATTAAAACTACGTAACGATTTG-3’，

mRCR_R：5’-TGACTCTCGAGTGGATTAAAAACAACTCTACCTTCATAAGCATTGTT-3’，