[发明专利]一种嗜群血蜱的重组亚单位疫苗及其制备方法

权利要求书

1.一种嗜群血蜱的重组亚单位疫苗，其特征是，由嗜群血蜱抗原性基因重组蛋 白与弗氏完全佐剂混合构成，其中所述抗原性基因重组蛋白含量50mg/mL，由 50mL rHc-23与950mL弗氏完全佐剂混合配制而成，其氨基酸序列为序列表 SEQID NO：1所示序列。

2.根据权利要求1所述的嗜群血蜱抗原性基因的核苷酸序列为表SEQID NO：2 所示序列。

3.根据权利要求1所述的一种嗜群血蜱的重组亚单位疫苗抗原性基因重组蛋白 的制备方法，其步骤如下：

(1)根据所述的核苷酸序列表SEQID NO：2所示的核苷酸序列，设计分别含 EcoRI和Hind III酶切位点的引物为

5’-CGGAATTCATGGGAGACGAGGAGAAGAG-3，；

5’-GGGTTCGAATTGCCTCGTTGTTTATTCCT-3’

(2)扩增出Hc-23基因，以Hc-23基因为模板进行PCR扩增，将回收的PCR 产物用限制性内切酶进行双酶切，然后与经过同样酶切处理的pMD18-T表 达载体行连接，转化到受体菌中，获得含有Hc-23基因的pMD18-T-Hc-23 重组表达质粒；

(3)以测序正确的阳性克隆pMD18-T-Hc-23质粒为模板进行PCR扩增，回收 目的片段进行亚克隆，即将PCR产物克隆入pMD18-T载体，最后亚克隆入 pET-32a(+)表达载体；

(4)用内切酶EcoR I和Hind III分别对阳性重组质粒和表达载体pET32a(+)进 行双酶切，获得含黏性末端的目的片段和线状载体；

(5)在16℃条件下用T₄DNA连接酶连接后转化感受态细胞DH5a；

(6)将鉴定正确的pET32a-Hc-23重组表达质粒转化表达宿主菌BL21(DE3) 进行原核表达，将表达重组蛋白收集、纯化即得；

(7)进行SDS-PAGE电泳检测得到重组rHc-23蛋白；

(8)表达蛋白分离纯化步骤：

取经IPTG诱导培养好的表达菌液500mL，用50mL离心管，10000r/min 离心5min，弃上清，留沉淀；在沉淀中加入20mmol/L pH为8.0的Tris-HCl 10 mL进行悬浮，然后将浓度为10mg/mL的1mL溶菌酶加入悬浮液中，37℃振 摇过夜，-20℃培养过夜；在功率为200W的超声破碎仪下，按30s/次，破碎处 理10次，10000r/min离心10min，上清另存备用，沉淀用2mol/L尿素 +1％TritonX-100+50mmol/L NaCl+0.2mmol/L EDTA洗两次，再用2mol/L尿素 +1％TritonX-100洗两次；10000r/min离心10min后弃上清，沉淀为所表达的蛋 白。