[发明专利]一种L-艾杜糖脱氢酶及其编码基因与应用有效
申请号: | 200910265308.8 | 申请日: | 2009-12-29 |
公开(公告)号: | CN102108343A | 公开(公告)日: | 2011-06-29 |
发明(设计)人: | 吴洪涛;修建新;杨丽霞;朱欣杰;崔永涛;黄艳敏;米造吉;谢萍;孙君伟;李锦;贾茜 | 申请(专利权)人: | 华北制药集团新药研究开发有限责任公司;河北维尔康制药有限公司 |
主分类号: | C12N9/02 | 分类号: | C12N9/02;C12N15/53;C12N15/63;C12N1/21;C12N1/19;C12P7/60;C12R1/19;C12R1/84;C12R1/01 |
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地址: | 050015 河*** | 国省代码: | 河北;13 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 艾杜糖 脱氢酶 及其 编码 基因 应用 | ||
技术领域
本发明涉及基因工程领域,具体涉及一种L-艾杜糖脱氢酶及其编码基因与表达方法、应用。
背景技术
维生素C对人类来说是非常重要且必不可少的营养因子。维生素C还用于动物饲料,尽管一些畜牧动物自身体内可以合成维生素C。在过去的几十年中,已通过公认的Reihcstein方法从D-葡萄糖对维生素C进行了工业生产。该工艺中只有一个步骤(D-山梨醇到L-山梨糖的转化)是通过微生物转化进行的,其它步骤都是通过化学方式进行的。维生素C的化学生产方法具有诸多缺陷,例如高能耗以及大量使用有机及无机试剂。因此,在过去的数十年中,人们一直在研究更加经济且环保的用微生物转化来生产维生素C的方法。
2-酮基-L-古龙酸(2-KGA)是合成抗坏血酸(维生素C)的重要中间体。已知有多种微生物能将L-山梨醇/山梨糖转化为2-KGA,如Stoddard等所用的NRRLB-21627(美国专利US5834231),T.Hoshino等所提到的DSM4025(欧洲专利EP9611500.8),尹光琳等提到的SCB329等(中国专利CN96116464.6)。有文献报道用微生物能够将L-山梨糖转化为2-KGA,例如,美国专利US3907.639公开了属于醋菌属、假单孢菌、沙雷氏杆菌、葡萄状球菌、气杆菌、产碱杆菌、青霉菌、假丝酵母以及葡萄糖酸菌的微生物具有上述转化活性。
对比化学合成法生产维生素C的七步化学反应,用微生物经2步发酵由山梨醇生成2-KGA,再经甲醇酯化生成维生素C是目前中国通用的方法。但在2步 发酵中使用了3种微生物,即在由L-山梨糖到2-KGA的转化过程中有2种微生物参与,其中一个是转化L-山梨糖为2-KGA的酮古龙酸菌。但是,酮古龙酸菌通常单独生长较慢,2-KGA的转化率较低,所以目前工业生产应用的均是采用两菌共生,如枯草杆菌、苏云金芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌等与酮古龙酸菌共同发酵。因此,在实际生产中存在相当多的问题,比如转化率低、工艺控制较为复杂等。
发明内容
酮古龙酸菌在将L-山梨糖转化为2-KGA的过程中,其中2-KGA旁路代谢的关键酶——L-艾杜糖脱氢酶会将2-KGA转化为L-艾杜糖酸,这条代谢途径对于2-KGA的生产是不利的,降低了2-KGA的产率。本发明采用同源重组的方法用体外突变失活的L-艾杜糖脱氢酶基因替换酮古龙酸菌基因组上正常的L-艾杜糖脱氢酶基因,对酮古龙酸菌中编码L-艾杜糖脱氢酶的基因进行敲除,使宿主菌中的L-艾杜糖脱氢酶基因永久失活,阻断了2-KGA到L-艾杜糖酸的代谢途径,使得已产生的2-KGA不再被代谢为L-艾杜糖酸,提高了2-KGA的产量和质量。
本发明的目的之一是提供一种L-艾杜糖脱氢酶及其编码基因。
本发明所提供的L-艾杜糖脱氢酶(rIDH)是具有序列表中SEQ ID №:2氨基酸残基序列的蛋白质或与序列表中SEQ ID №:2的氨基酸残基序列具有至少80%同源性且具有与SEQ ID №:2相同活性的由SEQ ID №:2衍生的蛋白质。本发明的L-艾杜糖脱氢酶分子量为35,730道尔顿。
所述SEQ ID №:2来源于酮古龙酸菌(Ketogulonogenium vulgarum)Welcome S,由343个氨基酸残基组成。其中,酮古龙酸菌(Ketogulonogenium vulgarum)Welcome S已于2009年12月16日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址:湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学),保藏号为CCTCC NO:M209304。
所述与序列表中SEQ ID №:2的氨基酸残基序列具有至少80%同源性且具有与SEQ ID №:2相同活性的由SEQ ID№:2衍生的蛋白质优选为与SEQ ID №:2具有至少90%同源性且具有与SEQ ID №:2相同活性的由SEQ ID №:2衍生的蛋白质,尤其优选为将SEQ ID №:2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №:2相同活性的由SEQ ID №:2衍生的蛋白质。
所述L-艾杜糖脱氢酶可为序列表中SEQ ID №:1的DNA序列或与序列表中SEQ ID №:1具有至少80%同源性的DNA序列在宿主菌大肠杆菌或毕赤酵母中表达得到的蛋白质。
本发明提供的L-艾杜糖脱氢酶的编码基因,是下列核苷酸序列之一:
1)序列表中的SEQ ID №:1;
2)编码序列表中SEQ ID №:2蛋白质序列的多核苷酸;
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