[发明专利]GLP-1受体激动剂生物学活性测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物活性测定方法，更具体的说涉及GLP-1受体激动剂的生物活性测定方法。

背景技术

糖尿病已成为威胁人类生命健康的重大疾病，糖尿病药物研究中GLP-1受体激动剂占据着越来越重要的地位【药品评价.2009，24(1)：32-33；药品评价.2008，5(11)：504-505】；GLP-1受体激动剂主要有胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、促胰岛素分泌肽(Exendin-4)、人GLP-1类似物利拉鲁肽(Liraglutide)，其生物学活性的测定由于没有活性测定国际标准品而成为一大难点【中国生物制品学杂志.2004，17(1)：29-31】。

GLP-1受体激动剂的生物学功能主要是特异性地与胰岛细胞的GLP-1受体相互作用，引起相应的信号通路改变，诱导胰岛素的分泌。根据这些生物学功能，测定其生物学活性目前主要有三大类：动物实验【Chin J Chin Pharmacol Ther2004，9(5)：527-531】、淀粉酶释放分析实验及细胞测定实验。

动物实验通常需要模型动物，不易获取、成本高，而且只能统计分析是否有活性，只能进行定性分析；淀粉酶释放分析实验的敏感性较差，线性关系不好，仅能作为半定量实验。

细胞测定实验包括第二信使(cAMP)酶链免疫反应分析实验【药物分析杂志。2006，26(12)：1691-1693】和化学发光物测定实验【南开大学学报.2007，40(1)：92-98】。前者是对信号通路改变过程中cAMP的测定，但由于cAMP在细胞内不稳定存在，易被降解，且cAMP可由多种途径产生，因此专一性不高；再者，使用到的RIN-5F细胞并不是对GLP-1受体这一类激动剂都灵敏，没有普 遍的适用性。化学发光物测定实验需要构建特定的细胞，使之能分泌特定的酶催化底物化学发光，需要花费大量的成本和较高的技术力量【生物化学与生物物理进展.2004，31(4)：36-40；生物技术通报.2007，3：118-121】。而且这两者都只是对中间产物的测定，并不是针对GLP-1受体激动剂的生物学功能(诱导分泌胰岛素)这一原理设计的。

相比较而言，本发明的设计就紧密结合这个药理学原理来设计，专一的对终产物胰岛素进行测定，更能体现出药品的实际效果，使得方法更合理、更科学、更实用。其优势具体表现在：

首先，本方法可得到GLP-1受体激动剂促进分泌胰岛素的效应曲线，以此测定GLP-1受体激动剂的生物学活性，能够得出相对精确的效价。而现有的通过模型动物的方法只能定性的确定GLP-1受体激动剂是否有促进分泌胰岛素的作用。

其次，本方法中测定关键物是胰岛素，它是GLP-1受体激动剂与GLP-1受体相互作用后，引起相应的信号通路改变，诱导的最终产物，稳定性高，基本不受细胞内其它物质的影响。且本发明的设计紧密结合GLP-1受体激动剂的药理学原理，专一针对终产物胰岛素，更能体现出药品的实际效果，使得方法更合理、更科学、更实用。而现有的实验方法，不论是以cAMP，还是以化学发光物为目标检测物的细胞试验方法，这两者都只是对中间产物的测定，易降解，不稳定，且中间产物有多种产生途径。

再者，化学发光物测定法所需的细胞需要特定构建，才能使之能分泌能被检测的化学发光物质，需花费大量的成本、较高的技术力量和较长的时间。而本发明用到的Min-6细胞培养条件简单，生长容易，便于操作。

发明内容

本法系根据GLP-1受体激动剂可以促进小鼠胰岛瘤细胞(Min-6)分泌胰岛素的作用，用小鼠/大鼠胰岛素试剂盒定量分泌的胰岛素，于波长450nm，参比波长590nm处测定其吸光度，可得到GLP-1受体激动剂诱导Min-6细胞分泌胰岛素的效应曲线，以此测定GLP-1受体激动剂生物学活性。

由于GLP-1受体激动剂作用于Min-6细胞有一定的葡萄糖浓度要求，本发明通过调节培养基葡萄糖的浓度，在加标准品供试品前使用无糖的培养基培养靶细胞，并用高糖测定培养基溶液稀释标准品供试品，提高Min-6细胞的敏感度。本发明中稀释标准品和供试品的测定培养基的葡萄糖浓度优选为25mM至75mM，更优选为50mM。

本法对于用消化液制成的细胞悬液的浓度有一定的要求；在本发明中，细胞悬液的密度优选为5×10⁵个/ml。

本法对于细胞加入无糖DMEM培养基后的培养时间有一定的要求；在本发明中培养时间优选为1-6小时，更优选为2-4小时。