[发明专利]启动子核酸；包含其的表达盒、载体和宿主细胞；和使用该细胞表达基因的方法

说明书

本申请是于2005年12月16日提出的国际申请PCT/KR2005/004338(国家申请号：2005800435515，发明名称：来自棒杆菌属细菌的新的启动子核酸、包含该启动子的表达盒和包含该表达盒的载体、包含该载体的宿主细胞和使用该细胞表达基因的方法)的分案申请。 

技术领域

本发明涉及来自棒杆菌属细菌的新的启动子核酸、包含该启动子的表达盒、包含该表达盒的载体、包含该载体的宿主细胞和使用该宿主细胞表达基因的方法。 

背景技术

棒杆菌类细菌是用于产生用于许多应用的多种化学物质的微生物，所述化学物质为如动物饲料、药品，和食品，包括L-赖氨酸、L-苏氨酸，和多种核酸。通过遗传工程和代谢工程可以开发显示出高生产力的棒杆菌菌株。为了得到显示出高生产力的棒杆菌菌株，需要在棒杆菌中表达涉及多种代谢途径的基因。为此，必须开发合适的启动子。 

通常，在棒杆菌中，基因在内在地包括在该基因中的启动子的控制下表达(见例如，Journal of Bacteriology，181(19)，6188-6191，1999)。同时，在棒杆菌细菌中表达基因的启动子序列的结构是未知的，而其他工业微生物，如大肠杆菌(E.coli)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的结构是已知的。因此，已经提出了下面的方法用来产生能够使基因在棒杆菌细菌中表达的启动子。首先，除去耐受抗生素，如氯霉素的基因的启动子区。使用合适的限制酶单独地切割从棒杆菌细菌分离的染色体DNA，并将所得片段导入除去该启动子区的基因中。然后，所得基因用于转化棒杆菌细菌以产生转化的菌株并测量所转化的菌株的抗生素抗性(见Gene，102，93-98，1991；Microbiology，142，1297-1309，1996.)。具体地，已经开发了用于Corynebacterium ammoniagenesis中的非常少数目的启动子，Corynebacterium ammoniagenesis是一种已知的生产核酸的微生物。例如，在大肠杆菌中使用比tac启动子活性高约10％的启动子(见Biotechnol.Lett. 25，1311-1316，2003.)。然而，当它用于基因的大量表达时，这种启动子显示出低效率。美国专利号5,593,781公开了一种启动子DNA，其从黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)菌株MJ-233(FERM BP-1497)分离并且具有比tac启动子更高的活性。然而，这种从短杆菌属分离的启动子DNA在其他细菌中不能工作。因此，需要开发来自通过商业途径可获得的产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)并且在其他细菌中具有高活性的启动子序列。 

因此，本发明的发明人在产氨棒杆菌中寻找强启动子序列并且发现根据本发明的启动子可以在产氨棒杆菌中以高活性表达基因。 

附图描述 

图1显示了从产氨棒杆菌细菌提取的样品的二维电泳测定的结果，其中将测定结果进行银染并显影用于鉴定； 

图2图解了根据本发明的实施方案产生p117-gfp的筛选载体的方法； 

图3图解了根据本发明的实施方案从筛选载体p117-gfp产生包括启动子序列pcj1到pcj7的重组载体的方法。 

发明详述 

技术问题 

本发明提供了在棒杆菌中具有高活性的启动子。 

本发明还提供了包括所述启动子的表达盒和包括该表达盒的载体。 

本发明还提供了包括所述载体的宿主细胞。 

本发明还提供了使用所述宿主细胞表达基因的方法。 

技术解决方案 

本发明提供了包含至少一种选自由SEQ ID NO：1到7组成的组的多核苷酸的启动子。 

根据本发明的实施方案的启动子是分离的核酸并且具有启动子活性。这里，术语“启动子”指DNA区，RNA聚合酶结合该DNA区以起始基因的转录。术语“tac启动子”指通过将从大肠杆菌的色氨酸操纵子启动子的-35区得到的序列与从大肠杆菌的乳糖操纵子启动子的-10区得到的序列 融合得到的启动子。已知tac启动子具有高启动子活性。具有选自SEQ IDNO：1、4、5、6和7的至少一种核酸的启动子在棒杆菌属细菌中具有比tac启动子更高的活性。具体地，具有选自SEQ ID NO：1和4的至少一种核酸的启动子在棒杆菌属细菌中具有比tac启动子高4到10倍的活性。