[发明专利]一种检测兔骨形态蛋白2基因的方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，具体涉及一种检测兔骨形态蛋白2基因的方法及试剂盒。 

背景技术

骨形态蛋白(bone morphogenetic protein)是一簇能够诱导骨和软骨形成的细胞因子。骨形态蛋白与细胞表面的骨形态蛋白受体结合，引起细胞信号转导，使SMAD家族蛋白激活。最初发现了7种骨形态蛋白，其中骨形态蛋白2-7属于TGF-β家族蛋白，骨形态蛋白1属于金属硫蛋白。目前已经发现了20种骨形态蛋白，骨形态蛋白2和骨形态蛋白7有两种骨形态蛋白已经通过美国FDA认证。 

骨形态蛋白2和其他的骨形态蛋白一样，在骨和软骨的发育过程中起着重要的角色，骨形态蛋白2具备成骨能力，能够诱导成骨细胞向其他类型细胞的分化。在胶原中加入骨形态蛋白2来治疗骨缺损、以及各种骨伤疾病已经广泛得到应用，如在口腔临床治疗中，大量的应用的重组骨形态蛋白2。整形外科和口腔外科也已经广泛的使用骨形态蛋白进行临床的治疗。在再生医学领域，骨折损伤可在骨形态蛋白持续作用下完成愈合。 

目前，基因表达水平检测主要是通过聚合酶链式反应(PolymeraseChain Reaction，PCR)来完成，PCR是一项广泛应用于分子生物学的实验技术，通过热稳定的Taq DNA多聚酶，使模板中的单个或几个拷贝的基因片断在经过几十个热循环后进行指数扩增，达到数以百万计的 拷贝，是目前常用的基因表达相对定量检测方法，PCR产物经过电泳检测目的基因的表达量，由于不能够实时的监测反应的进行，所以实验的重复性、可靠性相对较差。 

随着分子生物学技术的不断发展，以及光电子技术的进步，近些年来实时荧光定量PCR(Realtime PCR)技术得到了很大的发展。实时荧光定量PCR通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析，能够全程实时检测PCR反应的进行，因此具有良好的实验可靠性，重复性。 

实时荧光定量PCR分为荧光染料掺入法和探针法。荧光染料掺入法是在PCR反应体系中加入荧光染料SYBR Green，SYBR Green I是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料。与双链DNA结合后，其荧光大大增强。在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBR Green只有和双链DNA结合后才发荧光。变性时，DNA双链分开，无荧光信号，因此必须在延伸结束阶段采集荧光信号。SYBR Green也能和非特异的双链DNA结合发光，所以必须在反应结束时做熔解曲线分析产物的特异性。 

探针法如TaqMan探针是一种寡核苷酸探针，是在寡核苷酸两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭剂则在3’末端。当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭剂接近而被淬灭。但在进行延伸反应时，聚合酶的5’外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭基团分离，探针被打碎，这样报告荧光基团不再被淬灭。随着引物的退火，产物的不断扩增，荧光基团不断被DNA聚合酶从探针上 剪切下来，从而不断发射出荧光信号，因此应用Taqman探针法能够快速准确的检测组织和细胞中的基因的表达变化。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种灵敏度高、特异性强的检测兔骨形态蛋白2基因的方法。 

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 

一种检测兔骨形态蛋白2基因的方法，包括： 

(i)用核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的下游引物扩增生物样品； 

(ii)用探针对扩增产物进行检测，所述探针序列如SEQ ID NO.3所示。 

优选地，步骤(i)所述扩增与步骤(ii)所述检测同时进行。 

更优选地，采用实时荧光定量PCR法进行步骤(i)所述扩增与步骤(ii)所述检测。所述实时荧光PCR法反应程序优选为：95℃10min；95℃ 30sec；58℃ 1min；72℃ 1min为一个循环，设定45个循环。