[发明专利]慢病毒载体介导的基因转移及其用途

说明书

本申请是2001年12月18日提交的CN 01822491.1，题为“慢病毒载体介导 的基因转移及其用途”的分案申请。

发明领域

本发明总体上涉及载体和基因治疗的分子生物学领域。更具体地，本发明涉 及在人基因疗法中采用慢病毒载体治疗遗传和增生性眼病。

相关技术的描述

人失明的最常见原因之一是眼内细胞异常增殖。由于牵引力直接施加于视网 膜表面，所以眼内细胞增殖通常导致视轴清晰度的丧失或视网膜与视网膜色素上皮 (RPE)的分离。增生性视网膜脱离，不许其是否与增生性糖尿病性视网膜病(PDR)、 早产儿视网膜病(ROP)、增生性玻璃体视网膜病(PVR)或新血管老年相关性黄斑退变 (AMP)有关，如果不治疗最终导致永久性丧失视觉。

眼内新血管的异常增生一眼新血管形成是发展中国家中永久性失明的最常见 原因。三种疾病与大多数的眼内新血管形成的所有病例有关：糖尿病、早产儿视网 膜病和老年相关性黄斑退变。然而这三种临床病种是有差别的，且影响不同类型的 患者，他们具有最终的共同途径，该途径涉及导致新血管形成的内皮细胞的失控性 分裂，而新血管形成最终危及视网膜功能。在美国这些情况约占不可治疗失明的 60％。

视网膜内血管内皮细胞的增生引发增生性糖尿病视网膜病。如果不治疗，这 些内皮细胞继续分裂，最后形成纤维血管膜，此纤维血管沿着视网膜的内表面延伸， 或者进入玻璃体腔。后玻璃表面的收缩造成在玻璃体-纤维血管粘附部位上的牵引， 最终脱离视网膜。在糖尿病诊断的20年内，约50％I型糖尿病患者将发生增生性糖 尿病性视网膜病，而10％2型糖尿病患者在类似时间范围内将出现增生性糖尿病性 视网膜病。

血管通常是由两个过程中的一个产生的，即血管发生或血管生成。在血管发 生期间，在胚胎发生时通过多能间充质祖细胞的成熟建立了毛细血管的原始网络。 相反，血管生成指涉及原先存在的血管的重建过程。在血管生成中，从较老、建立 的血管中发出新血管芽，并入侵周围组织。在视网膜中，一旦建立了正常的血管网 络，此网络的重建大多在组织氧浓度的影响下一缺氧(氧少)刺激血管生成。此过程 导致社会中数百万糖尿病人、早产儿或老年人失明。

因此，眼内疾病如老年相关性黄斑退变、增生性糖尿病性视网膜病、早产儿 视网膜病、青光眼和增生性玻璃体视网膜病的特征是异常增生或基因治疗可能有用 的其它状态。但是，在哺乳动物细胞中进行高效基因转导是困难的。此外，用传统 的载体如腺病毒载体、脂质体和基于树型化合物的试剂所见的结果是十分短暂的。 将这些载体导入眼内而不引起强的炎性反应也是有问题的。

因此，先有技术的缺陷是缺乏在眼内转导终末分化或增殖的人细胞或衍生自 眼的细胞的方法。

发明概要

本发明的目的是开发慢病毒载体和在遗传和增生性眼病的人基因疗法中使用 这些载体的方法。描述了慢病毒载体对于转导人视网膜、角膜、血管内皮、增生性 玻璃体视网膜细胞和视网膜色素上皮细胞的用途。

在本发明的一个实施例中，证明了通过慢病毒递送的组成型活化的(突变体或 变体)视网膜母细胞瘤(CA-rb)基因，来抑制眼内细胞分裂的可能性。在体外测试了 人眼细胞和在体内测试了两种模型的眼内增生性疾病(增生性玻璃体视网膜病和晶 状体摘除术后后囊浑浊)。在许多不同类型的细胞中观察到体外细胞分裂的明显和 历时长久的抑制作用。在体内观察到增生性玻璃体视网膜病和晶状体摘除术后后囊 浑浊的严重性降低。

在本发明的另一实施例中，证明了在新血管生长(血管生成)或预编程性细胞 死亡(凋亡)的发生和抑制中已知是重要的慢病毒介导的基因转换，可用于治疗病理 性眼血管生成(如糖尿病性视网膜病或“湿性”老年相关性黄斑退变)或病理性细胞 死亡(如“干性”老年相关性黄斑退变)。在家兔模型中证明了将这些基因置于两种 分开的强启动子之一的控制下，已知在人视网膜、角膜和视网膜色素上皮细胞中有 活性，并且抑制角膜的新血管形成。

此外，当携带已知在遗传性眼病的人患者中缺损的基因时，此载体系统可将 这些基因转移到人眼细胞中。通过此系统转移这些基因形成了治疗这些眼病患者有 效疗法的基础。

本发明涉及在需要这种治疗的患者(如眼病患者)中抑制眼内细胞增殖的方 法。该方法包括的步骤是：给予所述患者含药理学上有效量的有抑制眼内细胞增殖 的治疗性基因的慢病毒载体。