[发明专利]间歇式回流细胞高生产率发酵生产有机酸的方法

说明书

技术领域：

本发明属于生物过程工程领域，具体涉及间歇式回流细胞高生产率发酵生产有机酸的方法。

背景技术：

有机酸是指一些具有酸性的有机化合物，最常见的有机酸是羧酸，是有机合成、工农业生产和医药的工业原料。目前，有机酸中的乳酸和各种氨基酸的应用越来越广泛，如乳酸是一种用途很广的有机酸，可用于酿造、医药、皮革、卷烟、化工、食品、印染等各方面，市场需求量很大，特别是作为新型可生物降解高分子新材料——聚乳酸(PLA)的主要生产原料，具有较大的潜在市场需求。氨基酸在医药、食品、化工以及有关生物研究领域中用途广泛，市场需求量不断增加。目前，利用玉米、大米和小麦等淀粉质的农产品原料，以及木薯、黄姜等非粮原料，发酵生产有机酸是经济有效的方法。用于有机酸发酵生产的微生物有细菌、放线菌和真菌，其中细菌种类多、转化率高、发酵周期短，在工业生产上应用较多。目前有机酸的发酵生产主要采取单批发酵方式，发酵周期较长，生产率较低，导致有机酸能耗较大，生产成本较高。细胞再利用技术在植物细胞培养生产生物药物和利用真菌细胞发酵生产乳酸上已有报道。如崔亨均等通过重复利用细胞的方法大幅度提高紫杉醇的产量(通过分批或半连续培养大量生产紫杉醇的方法，申请号01144877.6)，姜绍通等反复利用米根霉菌球体实现多批次生产L-乳酸，大幅度缩短了发酵时间(米根霉菌球体单罐半连续高强度发酵高光学纯度L-乳酸新工艺方法，申请号200710131513.6)。但以上专利对发酵过程细胞再次利用的控制方法阐述不多，并且目前尚未发现高效利用细菌和基因工程酵母细胞高生产率发酵生产有机酸的报道。

发明内容：

为解决有机酸发酵生产发酵周期长、生产率不高的突出问题，本发明通过间歇式回流细胞和即时补充新鲜培养基的方法，使发酵过程保持高生物量，达到高生产率生产有机酸的目的。实现本发明的技术方案是：

间歇式回流细胞高生产率发酵生产有机酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、灭菌：对用于有机酸发酵生产的种子罐、发酵罐、缓冲储罐、过滤装置及其连接管道进行蒸汽或杀菌剂灭菌；

步骤二、制备无菌的种子培养基：用经过灭菌的过滤装置对种子培养基进行过滤，得到无菌的种子培养基清液，将该种子培养基清液送入种子罐；

步骤三、制备高密度的种子液：根据所要生产的有机酸选择用于有机酸发酵生产的菌种，将所选的菌种接入已装有种子培养基清液的种子罐中，当菌种培养8～60h进入其生长曲线的对数生长期时，将得到的种子培养液用无菌的过滤装置过滤浓缩，使过滤装置截留的种子浓缩液中生物量的干重达到2～30g/L，此种子浓缩液即为高密度种子液；

步骤四、制备无菌的发酵培养基：将用于有机酸发酵生产的发酵培养基通过无菌的过滤装置过滤后，得到无菌的发酵培养基清液，将该发酵培养基清液的一部分送入发酵罐，另一部分存放于无菌的缓冲储罐中备用；

步骤五、间歇式回流细胞法发酵生产有机酸：将步骤三所制备的高密度种子液接种到发酵罐内，在有利于所选菌种合成有机酸的发酵条件下进行培养，采用加入碱性中和剂控制pH的方法来解除发酵产酸导致的有机酸反馈抑制，发酵过程中监测发酵罐中发酵液的残糖浓度，当发酵液残糖浓度降至1.1～10g/L时，同时进行以下(1)和(2)的操作：

(1)将发酵液从发酵罐内排出，在发酵液排出的过程中监测发酵罐中发酵液体积的变化，当发酵罐中的发酵液排出了其总体积的30～100％时停止排放，随即向发酵罐中补充新鲜的无菌的发酵培养基清液，补充的新鲜发酵培养基体积不大于排出的发酵液体积，于是，发酵罐中的糖浓度大于发酵液刚从发酵罐内排出时的浓度；

(2)将排出的发酵液送入无菌的过滤装置过滤，滤出的发酵清液用于提取有机酸，将被过滤装置截留的菌体细胞浓缩液再送回到发酵罐作为生产菌继续使用；

当发酵罐中的残糖浓度再次降至第一次排出发酵液时的残糖浓度范围，且与第一次排出发酵液前相比，有机酸生产率没有出现下降时，再次同时进行以上(1)和(2)的操作；

当发酵罐中的残糖浓度再次降至第一次排出发酵液时的残糖浓度范围，且与第一次排出发酵液前相比，有机酸生产率出现下降且不超过10％时，随即向发酵罐内补充用前述步骤三所述方法制备的高密度种子液，并再次同时进行以上(1)和(2)的操作；