[发明专利]检测结核杆菌的壳聚糖-纳米金酶免疫传感器及其应用

权利要求书

1.一种检测结核杆菌的壳聚糖-纳米金酶免疫传感器，其特征在于，它由玻碳电极、位于该玻碳电极表面的碱性磷酸酶标记的羊抗鼠-壳聚糖-纳米金修饰膜和固定在该修饰膜表面的结核杆菌单克隆鼠抗体构成。

2.一种检测结核杆菌的壳聚糖-纳米金酶免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：

步骤一：取玻碳电极(φ＝3mm)用0.3μm、0.05μm的氧化铝粉抛光成镜面，超声波清洗3min后三蒸水冲洗，在piranha溶液(30％H₂O₂∶H₂SO₄＝3∶7)中浸泡10min，然后分别用三蒸水和乙醇超声波清洗三次；

步骤二：将经抛光清洁处理过的玻碳电极插入0.1mg/mL碱性磷酸酶标记的羊抗鼠抗体(羊抗鼠IgG-ALP)、0.5％壳聚糖溶液和0.8nM纳米金(粒径15nm)混合溶液中，于三电极系统下给予电压恒压+3.0V下电沉积修饰5分钟，电极取出后分别用2mL的高纯水冲洗三次，即制得碱性磷酸酶标记的羊抗鼠-壳聚糖-纳米金膜修饰的玻碳电极；

步骤三：将步骤二制得的碱性磷酸酶标记的羊抗鼠-壳聚糖-纳米金膜修饰的玻碳电极插入含有0.1mg/mL的结核杆菌单克隆鼠抗体磷酸缓冲溶液中，于4℃浸泡10小时，取出后用2mLPH为7.4浓度为0.01M磷酸盐缓冲液冲洗电极表面三次，即得到本发明提供的检测结核杆菌的壳聚糖-纳米金酶免疫传感器，4℃储存备用。

3.一种检测牛奶中结核杆菌的方法，包括以下步骤：

步骤一：按以下步骤(a)或(b)对待检测牛奶样本进行前处理：

(a)取10ml待检测牛奶样品1900g离心20min，弃上清液，加入PH为7.4浓度为0.01M的PBS液5ml混匀，1900g离心10min，弃上清液，往沉淀物中加入0.5mlPBS，混匀备；

(b)对牛奶样本进行增菌培养，具体步骤为：10ml牛奶样品1900g离心20min，弃上清液，加入10ml Middledbrook7H9培养液，37℃，厌氧件条件下培养1-2天。然后1900g离心20min，弃上清液，加入PH为7.4浓度为0.01M的PBS液5ml，混匀，1900g离心10min，弃上清液，往沉淀物中加入0.5mlPBS，混匀备用；

步骤二：按权利要求2所述方法制备本发明提供的检测结核杆菌的壳聚糖-纳米金酶免疫传感器；

步骤三：标准结核杆菌液的制备：选用具有免疫原性减毒活牛分支杆菌制备而来的卡介苗，经Middledbrook7H9培养液，37℃，厌氧条件下培养，充分混匀以0.01M磷酸盐缓冲液PBS为稀释液进行1∶10的倍比稀释，再接种于罗氏斜面培养基，计算出菌落数，调整PBS对Middledbrook7H9培养液中BCG菌稀释度，分别配制从10²～10⁷cfu/mL之间不同浓度的结核杆菌BCG的PBS混悬液；

步骤四：测试本发明制备的检测结核杆菌的壳聚糖-纳米金酶免疫传感器的初始电流值I_O；

步骤五：将本发明制备的检测结核杆菌的壳聚糖-纳米金酶免疫传感器分别与前述步骤制备的不同浓度结核杆菌BCG的PBS悬浮液和待测样品的PBS悬浮液在37℃培育30分钟，然后，测试孵育后的电极的电流值I_P；

步骤六：用I_O减去I_P获得电流改变差值ΔI，以不同浓度结核杆菌BCG的PBS悬浮液与本发明制备的检测结核杆菌的壳聚糖-纳米金酶免疫传感器反应前和反应后引起的电流值改变ΔI绘制标准曲线，依标准曲线及待测样品的PBS悬浮液ΔI即得出待测样本中结核杆菌的浓度。

4.根据权利要求3所述的检测牛奶中结核杆菌的方法，其特征在于，步骤四所述的测试本发明制备的检测结核杆菌的壳聚糖-纳米金酶免疫传感器的初始电流值I_O的具体方法是：以本发明制备的检测结核杆菌的壳聚糖-纳米金酶免疫传感器为工作电极、饱和甘汞电极为参比电极和铂丝为辅助电极构成的三电极系统，5mMα-萘磷酸的PH为8的Tris-HCl缓冲液为测试工作液，用差分脉冲法扫描测定电流，扫描条件为起始电压0V、终止电压0.6V、幅度0.05V；记录在+300mv左右产生的氧化峰，以此氧化峰的电流值为本发明制备的检测结核杆菌的壳聚糖-纳米金酶免疫传感器的初始电流值I_O。