[发明专利]吸附重金属镉的重组恶臭假单胞菌CH01及应用

说明书

技术领域

本发明属环境工程土壤环境治理领域。具体涉及一种新的微生物修复重金属镉污染土壤的基因工程菌的构建和应用。本发明与微生物基因工程和环境工程领域有关。 

背景技术

镉是一种典型的分散型重金属元素，主要以硫化物的形式存在于铜、铅、锌等有色金属矿藏中。随着人类活动，镉以各种途径进入环境中，造成了严重的镉污染。镉在环境中有稳定积累和不易消除的特点，而镉迁移转化的最大特点是不能或不易被生物体分解转化后排出体外，不易随水移动，只能沿食物链逐级往上传递，通过食物链富集使人体慢性中毒。研究表明，镉同时对人类和动物具有致癌作用，镉污染地区居民的死亡率及癌症罹患率同非污染地区相比均呈现出上升的趋势。目前，镉已被国际癌症研究机构(IARC)归为第一类致癌物(McGregor et al.，2000)。 

在镉污染的土壤环境中的植物也会不同程度地吸收该重金属，使得根、茎、叶等器官及各种细胞器受到不同程度的伤害，使植物生物量下降。植物对镉的吸收取决于植物根系生理功能及根际圈内微生物群落组成、士壤的理化性质、重金属种类和浓度、氧化还原电位以及pH值等因素影响。部分植物对包括镉在内的重金属有较高的耐受和吸收性能而被用于修复重金属污染的土壤，但是目前筛选出的富集重金属的植物往往只对一种重金属元素表现出较强的富集能力，而对复合污染的几种重金属元素同时富集的能力较弱；同时还存在着植物生物量小、生长周期长以及扎根浅等问题。植物根际微生物与植物根系所组成的生态系统对重金属在根土界面的迁移转化有着重要的作用。根际微生物对重金属的吸附转化和固定能有效降低重金属对植物的伤害。而微生物对重金属的耐受和解毒能力也为微生物从功能上治理和修复重金属污染土壤提供了新的途径。 

在所有微生物修复重金属机制中，通过金属硫蛋白吸附重金属，特别是难于转化为低毒或无毒的镉一类的重金属受到我们特别的关注。金属硫蛋白(Metallothionein，简称MT)是一类低分子量，富含半胱氨酸，能够结合Cd、Zn、Cu等多种金属离子的蛋白质。1957年，Margoshes和Vallee首次从马肾中分离得到。在重金属吸附的利用方面，目前主要是将该类蛋白与周质空间或外膜组分融合后在大肠杆菌中表达，或者将MT的表达与金属膜转运蛋白的表达相结合(Jacobs，1989；Romeyer，et al，1990；Sousa et al.，1998；Valls etal.，2000；Valls et al.，1998)。但是大肠杆菌对重金属的耐受能力较弱，而工程菌吸附重金属后降低了工程菌的有效吸附周期，单个MT分子对于吸附效率和容量的提高也没有明显的增强。发明人所分离的一株高度耐受多种重金属的细菌，初步具备修复多种重金属污染的能力，同时也为构建高度重金属污染土壤修复工程菌提供了一个十分有效的宿主。 

微生物表面展示技术是利用基因重组方法把靶蛋白(外源肽段或蛋白质结构域)基因序列与特定的载体蛋白基因序列(又称定位序列)融合后导入微生物宿主细胞，从而使靶蛋白表达并定位于微生物细胞表面。被展示的多肽或蛋白质可以保持相对独立的空间结构和生物活性。微生物展示策略能够将参与重金属吸附的蛋白质表达在宿主细胞表面，这既增强了修复工程菌与重金属的接触，又能降低细胞内的重金属浓 度，从而增强工程菌的耐受能力。 

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，筛选一种新的微生物修复重金属镉污染土壤的基因工程菌。本发明还涉及该基因工程菌的构建和应用。 

本发明的技术方案如下： 

申请人通过基因工程的方法筛选获得一种能够修复重金属镉污染土壤的基因工程菌CH01，该菌株属于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)CH01，于2009年12月19日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为：CCTCC NO M209320。 

本发明的基因工程菌的制备方法是，首先将猴金属硫蛋白α结构域四聚体(mMT4α)融合在野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)ATCC33913冰晶核蛋白N端(inaX-N)，并以此为主要功能单元构建一个广宿主表达质粒。然后在本发明人所分离的高效耐受多种重金属的恶臭假单胞菌X4(Pseudomonas putidaX4)中利用镉特异性启动子进行表达，实现猴金属硫蛋白α结构域四聚体在该细菌的表面展示，从而获得高效专一吸附重金属镉的基因工程菌菌株，将该基因工程菌命名为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)CH01。