[发明专利]一种低氧条件下微囊化成骨细胞支持和调控造血干/祖细胞体外扩增的方法

权利要求书

【权利要求1】一种低氧条件下微囊化成骨细胞支持和调控造血干/祖细胞体外扩增的方法，其特征在于：

(1)人源成骨细胞的培养：采用健康儿童源髂骨松质骨，保持无菌，放于盛有PBS缓冲液的培养皿中，用眼科剪剪去除髂骨上的血块和软组织，至无肉眼可见的软组织和血块附着；更换PBS液，剪碎髂骨至约1mm3，用PBS液冲洗，吸去PBS液；将髂骨组织块移至离心管中，加入适量0.25％胰酶消化液，在37℃恒温水浴中搅拌消化15min，加10％新生牛血清DMEM培养液适量，终止消化；1000rpm离心5min后，弃上清；用1mg/ml的II型胶原酶消化，在37℃恒温水浴中搅拌消化90min，加10％新生牛血清DMEM培养液适量，终止消化；1000rpm离心5min后，弃上清；加10％新生牛血清DMEM培养液适量调节细胞浓度为1×105cells/ml浓度接种于T-flasks，置于5％CO2、37℃恒温培养箱中培养；待细胞生长至壁面85％融合后，传代两次，即可使用；

(2)成骨细胞包囊：取第3-6代成骨细胞进行共培养实验；用0.25％胰蛋白酶消化2-3min后用含血清的DMEM培养基终止消化，1000rpm离心10min，去除上清液，加入2.0％(w/v)明胶溶液重悬，调整细胞密度为2×106cells/ml，在37℃培养箱中孵育30min；按海藻酸钠:明胶＝3:1的比例加入2.0％(w/v)海藻酸钠溶液，混合均匀，室温下磁力搅拌反应10min，用PBS冲洗三次；然后将胶珠加到0.5％(w/v)壳聚糖溶液中，覆膜反应10min，用PBS冲洗三次，再用IMEM冲洗一次；将微囊加到6孔板中，并添加3mlIMEM，然后将孔板置于培养箱中孵育24h；分别制备两批微囊，放在常氧培养箱和低氧培养箱中；

(3)造血干/祖细胞的分离：脐带血采自健康足月分娩产妇；将采集到的含抗凝剂的脐带血缓慢叠加到Ficoll淋巴分离液上，两者体积比为2:1；然后，进行2500rpm25min密度梯度离心，吸取中间白膜层；将吸取到的细胞用含有10％胎牛血清的D-Hank’s平衡盐溶液1000rpm离心5min洗涤两次，之后调整密度接种到培养瓶中备用；在接种到6孔板共培养以前，单个核细胞在培养瓶中过夜；

(4)成骨细胞与造血干/祖细胞共培养：调整脐血单个核细胞密度为2×105cells/ml，接种于装有成骨细胞微囊的6孔板中，每孔添加3ml；培养基采用IMEM培养基并补充较低剂量的生长因子组合，包括2.4ng/ml IL-3、10ng/ml FL、20ng/ml SCF、2.0ng/mlGM-SCF和3.2ng/mlTPO；每24h，从6孔板中取出约0.2ml样品，以计总有核细胞密度，检测培养液pH值，葡萄糖和乳酸浓度，在0h和168h时，进行集落形成能力检测；

(5)收获造血干/祖细胞：使用PBS清洗成骨细胞微囊，使之和脐血单个核细胞分离；后离心，收获总有核细胞。