[发明专利]一种用于核酸扩增的环形引物及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及聚合酶链式反应(PCR)中所用的核酸扩增引物的设计与应用技术，特别是涉及应用在实时PCR反应中，尤其是在突变检测和稀有突变检测中的应用。

背景技术

聚合酶链式反应(PCR)技术是一种简单快捷、高灵敏、特异的基因扩增方法，其过程通常包括20-50个由变性、退火和延伸三步反应构成的循环。可以在1.5-3小时内特异地扩增靶核酸序列至几百万倍。近年来，由于实时PCR仪的出现使普通PCR不再需要凝胶电泳分析，从而不必PCR后操作，杜绝了PCR污染。因此实时PCR技术在临床上应用越来越广泛。实时荧光PCR检测技术最早使用荧光染料，例如SYBR GREEN，EVE-GREEN，以指示PCR反应。随后，实时荧光PCR检测技术中开始应用标记荧光的核酸探针，例如5’-核酸外切酶技术中使用的Taqman探针、分子信标、荧光能量转移探针(相邻探针)、蝎子引物、点亮探针等。染料法尽管简单，然而其无法识别非特异扩增，尤其是由于引物二聚体引起的非特扩增，因此在实际应用中受到很大限制。探针法对扩增产物具有第二识别步骤，从而避免了非特异扩增，结果更加可靠。不过，探针普遍存在设计复杂，合成成本高等缺点。这两类方法缺点的根源都在于它们不能有效防止非特异扩增。

稀有突变是指大量野生型基因背景下的极少的突变基因，特别是单碱基突变的基因。一般突变基因与野生型基因的比率小于1/1000。例如孕妇外周循环血中含有的微量胎儿突变基因，肿瘤病人血液中或肿瘤组织内含有的少量肿瘤体细胞突变。能否准确检测这类稀有突变对现有检测技术提出了挑战。

PCR方法用于突变检测的关键是根据目标基因顺序设计一对具有高严谨性的、与目标基因DNA或RNA互补的引物。扩增阻碍突变系统(Amplification Regractory MutationSystem，ARMS)技术于1989年建立，又称等位基因特异性PCR(Allele-specific PCR，AS-PCR)，也叫序列特异性引物PCR(PCR with Sequence Specific Primers，PCR-SSP)。在众多突变检测方法中应用最为广泛。其基本构思是设计2条ARMS上游引物，共用1条下游引物构成PCR反应体系。等位基因特异性碱基置于引物3’末端，这是因为耐热Taq DNA聚合酶缺乏3’-5’外切校正活性，在PCR反应进行时，位于引物3’末端的特异性碱基分别结合于野生型和突变型等位基因的位点，若此碱基对形成错配，DNA链延伸反应就会因为3’-5’-磷酸二酯键形成障碍而受阻。但是ARMS引物3’末端碱基对不同错配区分能力不同，因此对有些突变的区分能力有限。

发明概要

本发明涉及使用一种用于核酸PCR扩增的新式引物。该引物在设计思路上与前述的当前引物根本不同，通过巧妙的设计将引物的特异性大大提高。此引物特异性高、不形成引物二聚体、设计简单、易于合成，适合基因表达量的检测、SNP检测以及稀有突变检测。

本发明的引物包括两种，一种是单扩增环形引物，可以用于基因的普通扩增；另一种是具有双扩增功能的环形引物，特别适合突变检测系统，尤其是稀有突变检测体系。

本发明中涉及的单扩增环形引物技术是基于对靶核酸的直接杂交，该引物由于5端具有与引物3端互补的序列，可以形成一个环形结构，环形结构易于打开，因此对靶序列的扩增效率不受影响。针对突变序列的碱基可以是在引物3末端也可以在引物内部，成环序列的多少可以根据序列不同而进行调整，从而可以调整引物对突变序列识别的特异性。

本发明中的双扩增环形引物在引物内部引入一端通用标签序列，标签序列和环形引物按一定比例(标签序列一般为环形引物用量的10倍以上)，同时加入PCR扩增体系，在PCR循环的前2个循环，环形引物高特异地识别突变靶序列并进行初期扩增，从第3个循环开始，由于大量存在标签引物，标签引物大量扩增把初期积累的特异PCR产物急速扩增和放大，从而保持对稀有突变靶序列的极高特异性和极高灵敏度。

根据此，本发明的环形引物可以被用于实时PCR中靶核酸的检测。

本发明的探针所使用的核苷酸可以是DNA，RNA，LNA，或PNA，或任何非自然核苷组成。

本发明还涉及到环形引物技术的应用。