[发明专利]荧光定量PCR溶解曲线在监测TCR CDR3谱系漂移中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及监测TCR CDR3谱系漂移技术领域，特别是涉及用荧光定量PCR溶解曲线来监测TCR CDR3谱系漂移的应用。

背景技术

近年来，随着用于特异T细胞研究的四聚体技术、TCR免疫扫描谱型分析技术(Immunoscope Spectratyping)、转特异TCR基因小鼠技术等的发展和应用，T细胞的生长、分化、增殖在分子水平上的整体画面逐渐清晰，这使得对临床疾病整体样本中克隆增殖的肿瘤T细胞、特异应答/耐受T细胞的监测成为可能。这些技术中，能从整体水平上去分析特异T细胞的主要方法是TCRCDR3谱系多态性和长度分析技术(TCRCDR3谱系漂移分析技术或称T细胞免疫指纹技术)和ELISpot技术等，其中T细胞TCRβ链的CDR3谱型分析技术应用较广，目前已在感染性疾病(HIV、病毒性肝炎、麻疹等)、肿瘤(白血病、大肠癌、黑色素瘤等)、移植(肾和骨髓移植等)、自身免疫病(SLE、类风湿性关节炎等)中研究报道。

荧光定量PCR技术因具有特异性、准确性、全封闭反应等优点，已经成为分子生物学、分子免疫学等实验研究中的重要手段，近年来FQ-PCR中的SYBY Green荧光染料因能与所有的DNA双链相结合，对DNA模板没有选择性，适用于多种目的产物的检测，其中的FQ-PCR溶解曲线分析法是把PCR产物从一定的温度开始缓慢上升至95℃，扩增产物双链DNA随温度升高逐渐变性解链产生单链，嵌到双链中的荧光染料SYBR Green释放出来，反应中的荧光信号随之衰减，仪器自动检测反应管内荧光信号的变化，最后绘制出扩增产物荧光信号随温度变化的溶解曲线，对荧光信号强度变化的负一次导数与温度作图，则得到相应PCR产物的溶解曲线峰图。目前，荧光定量PCR溶解曲线主要应用于监测PCR反应产物的特异性。

国内外目前监测TCRCDR3谱系漂移采用的是基因扫描分析技术，即对TCR CDR3谱系进行“PCR”和“PCR产物扫描”分析，对标记的PCR产物进行测序仪的凝胶扫描或毛细管电泳PCR分析，了解TCR CDR3谱系漂移情况，但该方法成本高，操作复杂，因需进行两步的分析，干扰结果的因素也会增加。

发明内容

理论上，不同大小、不同基因所得到的PCR扩增产物的荧光定量PCR溶解曲线峰型图是不一样的，该PCR溶解曲线与TCR CDR3谱系漂移存在某种关系，本发明所要解决的技术问题就是提供荧光定量PCR溶解曲线在监测TCR CDR3谱系漂移中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案：

荧光定量PCR溶解曲线在监测TCR CDR3谱系漂移中的应用：将荧光定量PCR溶解曲线用于监测TCR CDR3谱系漂移。

上述荧光定量PCR溶解曲线应用于监测人体的TCR CDR3谱系漂移。

前述监测的方法为：分析荧光定量PCR溶解曲线，当该曲线出现单峰、寡峰或偏峰时，即存在TCR CDR3谱系漂移。

前述荧光定量PCR溶解曲线是这样得到的：首先对待测样本加入荧光染料进行PCR扩增，扩增产物以0.2℃/秒的速度从75℃增至95℃，每秒读取一次荧光值，100cycle，绘制出扩增产物荧光信号随温度变化的溶解曲线，对荧光信号强度变化的负一次导数与温度作图，即得待测样本的荧光定量PCR溶解曲线。

比如：TCRβ链CDR3谱系的溶解曲线分析技术是根据TCR基因重排规则，TRBV基因家族特点，设计26个β链特异性上游引物及1个共同下游引物TRBC，经荧光定量PCR扩增后，75℃～95℃时每升高0.2度读取一次荧光值(100cycles)得到每个家族溶解曲线图，从图上即可分析TCR CDR3的单/寡/多克隆性增生情况(谱系漂移)。

与现有技术相比，本发明将荧光定量PCR溶解曲线应用于TCR CDR3谱系漂移的监测，其中的“PCR”和“CDR3谱型”分析在封闭管中一步完成，因同时能对每个TRBV或TCRAV家族的CDR3 PCR产物进行相对定量和克隆增生情况分析，是一种较为简便的适用于临床样本研究的方法，特别适用于临床外周血和组织样本TCR CDR3谱系漂移的监测，经实验证实该方法准确、经济、简便、快速，在肿瘤、感染患者的T细胞应答机制上具有很好的理论和应用价值。

附图说明