[发明专利]一种利用血清中的微小核糖核酸诊断肝癌的新技术

说明书

一、技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及人血清微小核糖核酸分子的分离，定性和定量分析。同时也涉及肝癌的各种临床指征。具体来说它是一种利用血清中的微小核糖核酸的特殊变化诊断肝癌，预测肝癌发病过程，判断并发症的发生，复发的几率，及肝癌的预后，并分析药效和疗效的新技术。

二、技术背景

微小核糖核酸，英文名为microRNA，是一类长约19至23个核苷酸的非编码单链小核糖核酸分子，它们在进化上高度保守，广泛存在于动植物细胞中，目前已在人类、小鼠、大鼠等多种生物物种中鉴别出数百种微小核糖核酸。

微小核糖核酸在基因表达调控领域中起着超乎想象的重要作用，其序列、结构、丰度和表达方式的多样性，使之成为信使RNA强有力的调控因子。微小核糖核酸的发现丰富了人们对蛋白质合成控制的认识，补充了在RNA水平对分子进行更迅速更有效调节的新方式，展现了细胞内基因表达调控全方位多层次的网络系统。微小核糖核酸的发现也是对中心法则中RNA次要的中介角色的重要补充，它将促使生物学家重新思考细胞遗传调控及其生长发育等方面的重要问题。

微小核糖核酸与动物的许多正常生理活动密切相关，如生长发育、细胞调亡以及脂肪代谢等等。同时，微小核糖核酸也与许多病理情况存在千丝万缕的联系。已有研究表明，在慢性淋巴细胞性白血病以及Burkitt淋巴瘤中有几种微小核糖核酸均有不同程度的下调；并且，研究人员通过对人肺癌、肝癌等癌组织中微小核糖核酸表达谱分析比较，发现每一种肿瘤都有若干特定的微小核糖核酸的表达水平相对于正常组织发生了变化，这些现象提示了肿瘤发生和微小核糖核酸表达之间存在相关性。亦有研究证明，微小核糖核酸在心肌肥厚、心衰、动脉粥样硬化等心血管疾病的发生和发展中扮演重要角色。此外，微小核糖核酸还与二型糖尿病等代谢性疾病有关联。鉴于这些疾病发生的分子生物学本质是基因表达调控的紊乱，我们猜想微小核糖核酸这一类调控基因表达小分子标志物的变化很可能是疾病发生与发展的一个核心因素，对微小核糖核酸的研究与分析将为疾病的诊断与治疗提供新途径。

微小核糖核酸与疾病的关联有两个层面：首先，微小核糖核酸的变化可能是病因，这是因为疾病的抑制因子以及促进因子都有可能是微小核糖核酸的靶位点，当微小核糖核酸发生了紊乱表达，其最终结果都会导致下游一系列基因表达的变化以及某些通路的整体紊乱，进而诱发疾病发生；其次，微小核糖核酸的变化也可以是疾病的结果，这是因为当疾病(如癌症)发生时，会导致染色体片段的丢失、基因的突变或者染色体片段的剧烈扩增，若微小核糖核酸正好位于这一变化区段内，那么其表达量将发生极其显著的变化。总之，微小核糖核酸完全可以作为一种新的疾病标志物，其在疾病过程中发生的特异性变化，可以帮助疾病定性，诊断疾病的发展阶段或分析疾病治疗过程中的药效和疗效。微小核糖核酸应用于临床医学将具有巨大的前景和经济效益。

目前对疾病进行临床诊断的生物化学及分子生物学手段还比较繁琐和粗糙，比如对于癌症的诊断，需要将手术标本进行组织细胞学染色检验，过程复杂并且耗时耗力。此外，目前尚没有一套早期预测及诊断重症疾病的方法。鉴于目前疾病诊断方法的单一以及早期发现与预判的困难，我们亟待找到一种比目前现有方法都更简单可靠同时又简单易行的新方法来鉴定疾病的发生以及判断病理阶段。我们选取血清中的微小核糖核酸作为研究对象，希望通过检测血清中的微小核糖核酸解决临床早期诊断等问题。检测血清中的微小核糖核酸有以下几个优势：首先，血清相对组织较易获得，甚至在平常体检中都可以收集到；其次，血清中的微小核糖核酸反映的是机体整体的生理病理情况，其检测结果具有指导意义；第三，血清中某些特定的微小核糖核酸可以指示特定的组织器官的病变，因此其又可以作为疾病诊断的一个参数。总之，检测血清中的微小核糖核酸，简单易行且效果优越，从血清中的微小核糖核酸的特异性变化这一新角度出发发现疾病并且区分程度，将建立一种更敏感更精确的用于疾病早期确诊的全新技术。

我们已经发现并证实血清、血浆中稳定地存在微小核糖核酸，每一种疾病都有其特定的变化图谱，且该种变化能被简单的方法检测到。该项发明已经申请了国内和国际专利。本申请是专门针对肝癌的诊断试剂盒的申请。

三、发明内容

本发明需要解决的问题是制备一种将血清中的微小核糖核酸的特异性变化应用于鉴定肝癌的PCR试剂盒，以提高肝癌的早期发现率以及确诊的准确性。

本发明的技术方案为：用定量PCR技术检测所有的血清中微小核糖核酸在肝癌时的变化趋势及变化量，将发生明显且稳定变化的那部分微小核糖核酸筛选出来，将其引物收集到定量PCR试剂盒中，就制成了专门针对肝癌的血清微小核糖核酸检测试剂盒。