[发明专利]一种肺癌血清学早期诊断试剂盒

说明书

技术领域

本方法涉及到一种ELISA试剂盒，该试剂盒能够准确、稳定、特异和灵敏的检测人体血清中eIF3a的表达水平，从而对肺癌早期诊断提供实验室检查依据。

背景技术

肺癌是我国和全世界范围危害人类生命健康的常见肿瘤。在全球，肺癌的发病率和死亡率均居癌症之首。同时，由于缺乏有效的早期发现手段，中晚期病例治疗花费大而且收效小，5年生存率仅约10％，使得肺癌防治成为癌症防治的重中之重、难中之难。

我国肺癌的发病率和死亡率一直呈明显上升趋势。20世纪90年代与70年代相比，我国肺癌的死亡率上升了111.85％。目前我国肺癌发病率已超过万分之三，达到十万分之三十五，成为发病率最高的恶性肿瘤。同时肺癌的死亡率已由20世纪70年代位居癌症死因的第4位攀升为第1位。由于已暴露的人群数目甚大，上升趋势至少要延续20～30年。

卫生部2006年5月29日发布《2006年中国“吸烟与健康”报告》。调查表明，我国肺癌的发病及死亡年龄有年轻化的趋向。报告显示，我国肺癌的发病及死亡年龄自40岁以后迅速上升，70岁达到高峰，75岁以后略有下降。女性和男性年龄发病率和死亡率的变化趋势基本一致。但在肺癌死亡率迅速上升的城市，不同时期的肺癌死亡率年龄曲线显示，肺癌死亡率高峰出现前移。

肺癌早期少有症状，因症状就诊者多属中晚期，疗效不佳。因而早期发现，早诊早治是提高肺癌治愈率、降低死亡率的关键。但是，目前全世界尚没有成熟的肺癌筛查方案。

eIF3a是一种新确定的肿瘤相关蛋白，它在肿瘤发生机制，维持恶性生物性状中具有重要作用，eIF3a的高度表达与细胞的分化增殖密切相关。现有研究表明eIF3a可能作为肺癌等常见恶性肿瘤的生物标志，对于肺癌早期诊断和分类，乃至预后具有临床意义。因此，检测eIF3a的表达水平可以用于早期诊断肺癌。

发明内容

本方法要解决的技术问题是，针对现有检测方法的缺乏，提出一种能够对人体血浆中eIF3a的表达水平进行定量检测的试剂盒，从而实现对肺癌进行早期诊断。该试剂盒具有可操作性强、可靠、稳定、特异性和灵敏度高等特点。

本发明肺癌血清学早期诊断试剂盒包括：人体eIF3a标准品蛋白、抗体包被的96孔板、样品稀释液、抗体稀释液、生物素标记抗体、亲和素-过氧化物酶复合物、亲和素-过氧化物酶复合物稀释液、TMB显色液、TMB反应终止液，抗体包被的96孔板中所述的抗体是免疫新西兰白兔产生的。

所述的人体eIF3a标准品蛋白是将eIF3acDNA PCR扩增后，构建pGEX-2T载体，转化大肠杆菌，原核表达后提取并纯化得到的蛋白，纯度大于85％。

抗体包被的96孔板中所述的抗体的制备过程如下：将纯化的150μg人体eIF3a蛋白分两次免疫雌性新西兰白兔，中间间隔30天，两次均为皮下注射；在每次注射后的7天开始收集兔血清2-4次，每次采血间隔两个星期，第一次100μl，第二次10-20ml，第三和四次为40ml，纯化抗体蛋白，抗体的效价为1∶5000。

所述的eIF3a抗体包被的96孔板，每孔包被4μg。

所述的样品稀释液为50mmol/L的碳酸盐缓冲液。

所述的抗体稀释液与亲和素-过氧化物酶复合物稀释液均为pH＝7.4PBST，配制如下：NaCl 2.0克、KH₂PO₄ 0.2克、Na₂HPO₄·12H₂O 2.9克、KCl 0.2克、NaN₃0.2克、加H₂O至1000ml，再加入Tween20 0.5ml。

TMB反应终止液为0.5M H₂SO₄。

本发明是以免疫学反应为基础，将eIF3a和其多克隆抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的检测方法。本反应主要在聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。

经过大量实验证明该多克隆抗体特异性和灵敏性均很高。其Western Blot检测结果如图1所示。A549，H1299，HepG2和Hela细胞株有eIF3a的表达，使用该抗体可以敏感的检测出eIF3a在上述细胞株中的表达，说明该抗体灵敏度较好。而NIH3T3无内源性eIF3a表达，该抗体没有检测出eIF3a，说明该抗体特异度较好。其具体检测方法如下：