[发明专利]一种采用磁珠从样品中提取并纯化核酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种采用磁珠从样品中提取并纯化核酸的方法。

背景技术

核酸的提取与纯化技术是生物化学与分子生物学的一项基本技术。随着分子生物学技术广泛应用于生物学、医学及其相关领域，核酸的提取与纯化技术也得到进一步发展。

核酸在细胞中总是与各种蛋白质结合在一起。核酸的提取主要是指将核酸与蛋白质、多糖、脂肪等生物大分子物质分离。大多数核酸的提取方法，一般都包括细胞裂解，去除与核酸结合的蛋白质及多糖、脂类等生物大分子，去除其它不需要的核酸分子，沉淀核酸，去除盐类、有机溶剂等杂质，纯化核酸等步骤。

1.细胞裂解：细胞裂解可通过机械作用、化学作用、酶作用等方法实现。

(1)机械作用：包括低渗裂解、超声裂解、微波裂解、冻融裂解和颗粒破碎等物理裂解方法，这些方法用机械力使细胞破碎，但机械力也可引起核酸链的断裂，因而不适用于高分子量长链核酸的分离；(2)化学作用：在一定的pH环境和变性条件下，细胞破裂，蛋白质变性沉淀，核酸被释放到水相，变性条件可通过加热、加入表面活性剂(SDS、TritonX-100、Tween20、NP-40、CTAB、sar-cosyl、Chelex-100等)或强离子剂(异硫氰酸胍、盐酸胍、肌酸胍等)而获得；(3)酶作用：主要是通过加入溶菌酶或蛋白酶(蛋白酶K、植物蛋白酶或链酶蛋白酶)以使细胞破裂，核酸释放。

2.酶处理：在核酸提取过程中，可通过加入适当的酶使不需要的物质降解，以利于核酸的分离与纯化，如在裂解液中加入蛋白酶(蛋白酶K或链酶蛋白酶)可以降解蛋白质，灭活核酸酶(DNase和RNase)，DNase和RNase也用于去除不需要的核酸。

3.核酸的分离和纯化：核酸的高电荷磷酸骨架使其比蛋白质、多糖、脂肪等其他生物大分子物质更具亲水性，根据它们理化性质的差异，用选择性沉淀、层析、密度梯度离心等方法可将核酸分离、纯化，现有分离纯化核酸的常规方法有：(1)酚提取/沉淀法：将细胞裂解后离心分离含核酸的水相，加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1体积)混合液，两相经漩涡振荡混匀(适用于分离小分子量核酸)或简单颠倒混匀(适用于分离高分子量核酸)后离心分离，再将核酸盐用有机溶剂沉淀，通过沉淀浓缩核酸，改变核酸溶解缓冲液的种类以及去除某些杂质分子；(2)密度梯度离心法：双链DNA、单链DNA、RNA和蛋白质具有不同的密度，因而可经密度梯度离心形成不同密度的纯样品区带，该法适用于大量核酸样本的制备；(3)层析法，层析法是利用不同物质某些理化性质的差异而建立的分离分析方法，包括吸附层析、亲和层析、离子交换层析等方法，在一定的离子环境下，核酸可被选择性地吸附到硅土、硅胶或玻璃表面而与其他生物分子分离；另外一些选择性吸附方法，以经修饰或包被的磁珠作为固相载体，磁珠可通过磁场分离而无需离心，结合至固相载体的核酸可用低盐缓冲液或水洗脱。

磁珠法是近几年才发展起来的核酸提取方法，其系列试剂不含氯仿、苯酚等毒性大的有机溶剂，提取纯化的核酸质量好、产量高，提取步骤更简单，不需要离心，易于实现自动化，这些优点及特点使其提取核酸的方法有替代所有其它方法的发展趋势。

磁珠是由磁性粒与各种含活性功能基团的材料复合而成的具有一定磁性及特殊表面结构的粒子。在生物磁性分离中，磁珠表面活性基团是一个非常重要的因素。目前使用较多的磁珠表面配基有单克隆抗体(Monoclonal antibody)、链霉亲和素(Streptavidin)、寡聚核苷酸(Oligonucleotides)，以及用硅烷化试剂在磁性微球表面引入氨基(-NH₂)，羟基(-OH)，巯基(-SH)，羧基(-COOH)，磺酸基(SO₃-)等，在此基础上，还可引入多糖类化合物(如纤维素、琼脂糖)、生物素、抗生物素等。

表面结合抗体的磁性微球，即所谓“免疫磁珠”，运用抗体与特异性细胞表面抗原结合的原理，用于血液中细胞的快速分离、骨髓中干细胞的分离富集。

链霉亲和素修饰的磁珠可用来提取分离核醣核蛋白/脱氧核醣核蛋白(DNP/RNP)。结合有生物素的DNA或RNA序列与链霉亲和素修饰的磁珠相互作用，蛋白质识别了这些序列，就可结合到固定化DNA/RNA上，这种方法被用来分离转录因子、限制性内切酶、复制蛋白等。