[发明专利]一种生物转化生产D(-)-酒石酸的工艺

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及一种D(-)-酒石酸的生产工艺，尤其是涉及一种利用环氧琥珀酸水解酶生物转化生产D(-)-酒石酸的工艺。

背景技术

像L(+)-酒石酸有很多重要用途一样，D(-)-酒石酸在食品、医药、化工和轻工业上都有不可替代的作用，D(-)-酒石酸有着比柠檬酸更强的酸味，因此可以用作食品酸味剂，也可以用作稳定剂和防腐剂。左旋的光学活性使得D(-)-酒石酸可在制药工业和轻工业行业中，充当手性拆分剂，目前已有很多这方面的报道。L(+)-酒石酸的生产方法已经研究的相当透彻，利用生物转化生产L(+)-酒石酸的技术也已经非常成熟，大规模的工业化生产已成为现实。而关于D(-)-酒石酸生产方法的研究却很少见报道，用化学拆分的方法拆分消旋的酒石酸可以得到L(+)-酒石酸和D(-)-酒石酸，但此方法操作困难，成本也高。生物转化不失为一种能源节约，环境友好的方法，目前发现的可以用生物转化的方法生产D(-)-酒石酸的微生物已有多种。1996年，日本学者Yamagishi等从自然界中分离到一株可以转化顺式环氧琥珀酸生成D(-)-酒石酸的菌株，对其生理生化特性的鉴定结果显示此菌为Pseudomonas putida。2000年，日本学者Ikuta等又分离到一株产D(-)-酒石酸的菌株，经过对其培养特性、生理生化特性、分类学特性进行鉴定和对16SrRNA的分析，认为此菌是产碱杆菌(Alcaligenes)，Asai等将Alcaligenes sp.内的顺式环氧琥珀酸水解酶用硫酸铵分级沉淀并以各种层析柱进行纯化，得到了分子量大小为80KDa的纯酶，此酶由分子量大小分别为40和35Da的两个亚基组成。然而，到目前为止还没有一个有效的用于生物法转化环氧琥珀酸为D(-)-酒石酸的生产工艺。

发明内容

针对现有技术中存在的上述不足，本发明提供一种生物转化生产D(-)-酒石酸的工艺，该工艺能使环氧琥珀酸在温和的催化条件下转化成D(-)-酒石酸。

本发明为达到以上目的，是通过这样的技术方案来实现的：首先从能降解环氧琥珀酸的微生物中提取顺式环氧琥珀酸水解酶，之后对纯化的酶进行固定化，以提高其稳定性，以便反复使用。然后用固定化后的酶作为催化剂，催化水解环氧琥珀酸生产D(-)-酒石酸。

进一步具体的说：本发明的目的是提供一种利用微生物所产生的环氧琥珀酸水解酶进行D(-)-酒石酸的生产方法。在该方法中首先利用诱导培养的方法对产环氧琥珀酸水解酶的菌株的环氧琥珀酸水解酶进行诱导，以提高酶的活性；之后对所产生的环氧琥珀酸水解酶进行纯化，并将纯化后的酶制成固定化酶用于D(-)-酒石酸的生产。

其中所用的产酶菌株可以是以现有报道的能降解环氧琥珀酸生产D(-)-酒石酸的菌株，如前文所述的Alcaligenes和Pseudomonas putida，也可以是以这此野中菌株的环氧琥珀酸水解酶基因克隆的工程菌。酶的纯化方法可以用现有的蛋白质纯化的方法。如最简单的硫酸铵沉淀，及各种柱层析法及超滤浓缩方法。酶的纯化纯度也可以根据需要进行调整。纯化方案可以根据所需酶纯度的要求，采用以上提到的一步或几种方案的组合。

酶的固定方法在下文的实施方案中以有详细说明。其中各组份的浓度可以根据实际的需求进行适当的调整。催化D(-)-酒石酸反应的温度可以在5-65度的范围中选择。其中的最佳反应温度为40-45度。酶催化反应的pH范围为5-10，其中的最佳反应pH为6.5-7.5。

本发明由于采用了适当纯化后的酶进行固定化，催化剂的比活大大增加，使反应时间与所需要的设备体积减少，从而可减少生产成本。本发明提供的固定化酶的方法，在该方法中将具有较强的机械强度的卡拉胶固定法与具有较强的稳定性和轫性的蛋白质(明胶与酶)共价交联法相结合，使固定化后的酶使用性能更佳，寿命更长，从而降低D(-)-酒石酸的生产成本。

附图说明

图1.各纯化过程中顺式环氧琥珀酸水解酶的聚丙烯酰氨凝胶电泳图，其中1：粗酶液、2：硫酸铵分级沉淀部分、3：DEAE-cellulose层析部分、4：Toyopearl HW-65疏水层析部分、5：分子筛层析部分。

具体实施方式

实施例

1、顺式环氧琥珀酸水解酶的提纯