[发明专利]核酸单分子测序方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域的测序方法，具体是一种核酸单分子测序方法。

背景技术

随着后基因组世代的到来，对DNA和RNA等生物大分子序列测定的需求大量增加。但目前的测序方法存在速度慢、费用高、有缺口、测序长度短或准确率底等问题，制约了相关学科的发展。2009年6月23日NCBI公布的结果，已完成真核生物基因组测序的22个，完成组装的174个，正在进行的172个。实际上，这仅仅是拉开了大规模基因组测序的序幕，因为对基因组测序的需要是多方面的，如个性化测序、动植物遗传改良中的单个个体测序、病原微生物的监控等等。但是，目前的方法难以满足多种测序的需求。当前的方法存在多种缺陷：速度慢、费用高、精确性差和一次性测序长度短，所以要研发新的测序技术以替代当前的测序方法。

经对现有技术的文献检索发现，John Eid等(2009)在《科学》以“单聚合酶分子的实时DNA测序”((Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules，Science，323∶133～138))为题报道了其研究结果：以零模波导(zero-mode waveguide，简称ZMW)将光聚集在亚波长特定区域内增强激发分子荧光发射、而较远的荧光迅速衰减的原理为基础，将DNA聚合酶固定于ZMW底部，与待测序单链DNA结合，将4种不同荧光标记的脱氧核苷三磷酸(简称dNMPs)，加入反应体系，只有正确配对而加入延伸链的dNMP所携带的荧光分子能被检测，实时检测加入的核苷酸，获得序列信息，再将ZMW做成阵列，提高测序通量。结果每一个ZMW的平均速度在4.7±1.7碱基/秒，准确率99.3％。因这种方法必需采用昂贵的荧光标记的dNMPs，因此，测序费用成了该方法广泛应用的主要限制因素。另外，准确率也远低于测序界提出的99.99％。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种核酸单分子测序方法。本发明可以直接测定无标记的天然核酸(包括DNA和RNA)序列，测定速度快、测定质量高、测定费用低。

本发明是通过以下的技术方案实现的，本发明包括如下步骤：

步骤一，分别检测脱氧腺苷5’一磷酸、脱氧鸟苷5’一磷酸、脱氧胞苷5’一磷酸、脱氧胸苷5’一磷酸、甲基化脱氧胞苷5’一磷酸、腺苷一5’磷酸、鸟苷5’一磷酸、胞苷5’一磷酸和尿苷5’一磷酸的拉曼光谱信号，建立标准曲线；

步骤二，利用外切酶酶切待测核酸分子，检测酶切后产物通过零模波导(ZMW)时受激光激发而发射的拉曼光谱信号；

步骤三，根据步骤一所得标准曲线，将步骤二所得拉曼光谱信号转换为具体的核苷酸，结合外切酶的切割方向，获得待测核酸分子的具体序列。

步骤二中，所述外切酶为每次只降解1个核苷酸，每秒降解15～1000个核苷酸的外切酶。

步骤二中，所述零模波导为金属薄膜基底中的圆形纳米孔，纳米孔的内径为50nm，深度为100nm。

步骤二中，所述零模波导为阵列形式。

步骤二中，所述拉曼光谱信号进行如下处理：用透镜收集拉曼光谱信号，之后透过滤波器去除杂散的激发光。

本发明可以直接测定无标记的天然核酸序列，测定速度快、测定质量高、测定费用低、基本不留缺口，可满足以DNA序列为基础的动植物及微生物的遗传改良、有害微生物的控制和各种生物基因组的大规模核酸测序的各种需求。本发明的方法不仅可检测核苷和脱氧核苷5’一磷酸，还可检测天然真核生物DNA中的甲基化胞苷。

附图说明

图1为测序流程示意图；

图2为拉曼光谱信号检测装置。

具体实施方式

以下实例将结合附图对本发明作进一步说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。