[发明专利]提高细胞中灵芝酸含量的灵芝细胞培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域的方法，具体是一种提高细胞中灵芝酸含量的灵芝细胞培养方法。

背景技术

灵芝(Ganoderma lucidum)为担子菌纲、多孔菌科、灵芝属高等真菌，作为一种传统的中药已有数千年的应用历史。药理研究表明，灵芝有广泛的药理作用，如抗HIV病毒，免疫调节，抗心肌缺血，调节血脂，降血糖，镇静作用，保肝作用，抗放射和抗化疗，抗缺氧和抗衰老作用等。近代人们开始研究通过人工栽培和深层发酵技术，获得大量灵芝菌丝体及其有效成分，为灵芝的药理学研究和产品开发提供了充足的原料。研究发现，灵芝中的有效成分主要包括灵芝多糖和灵芝酸，灵芝酸等三萜类化合物是灵芝类的主要化学成分之一。自1982年Kubota等人首次分离得到灵芝酸A，B类化合物以来，灵芝中已有200多种三萜被分离出来，其中100多种是灵芝酸。研究表明，灵芝酸T具有诱导肺癌细胞凋亡活性(Tang W.，Liu J.-W.，Zhao W.-M.，Wei D.-Z.，Zhong J.-J.Life Sciences，80(2006)205～211.)，而灵芝酸Me具有抑制肿瘤扩散(N.H.Chen，J.W.Liu，J.J.Zhong.Journal ofPharmacological Sciences，108(2008)212～216)和增强IL-2和IFN-γ表达以及增加NK细胞活性(G.Wang，J.Zhao，J.Liu，Y.Huang，J.-J.Zhong，W.Tang.InternationalImmunopharmacology，7(2007)864～870.)。

经对现有技术的文献检索发现，中国发明专利申请公开说明书CN1375557A披露了如下内容：钟建江和汤亚杰公开了生物反应器中灵芝细胞两阶段培养生产灵芝酸的方法，可以高效率生产灵芝酸，产量1066mg/L，细胞内含量达5mg/100mg干重；中国发明专利申请公开说明书CN1264743A披露了一种液体好氧发酵-液体静置培养法生产灵芝酸的工艺，使总灵芝酸的产量较一般液体好氧发酵法产量提高了2.3倍。但是，灵芝酸有较广泛的药理活性，对灵芝酸的进一步研究将有利于灵芝中有效成分的寻找和进一步探索新的活性并阐明其药理活性机制，灵芝酸在灵芝细胞中的含量一般很低，分离纯化也较难，这限制了灵芝酸的活性及作用机理的研究及广泛应用。如何进一步提高灵芝酸的产量是目前急需解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种提高细胞中灵芝酸含量的灵芝细胞培养方法。本发明使得灵芝菌丝体中总灵芝酸含量达到41.4mg/g干细胞，同时单体灵芝酸的含量也得到提高15％～60％。

本发明是通过以下的技术方案实现的，本发明包括如下步骤：

步骤一，配制种子培养基和发酵培养基；

所述种子培养基具体为，1L培养基由以下组分组成，葡萄糖35g，蛋白胨5g，酵母粉2.5g，磷酸二氢钾1.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，维生素B1 0.05g，余量为水；

所述发酵培养基具体为，1L培养基由以下组分组成，乳糖35g，蛋白胨5g，酵母粉5g，磷酸二氢钾1.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，维生素B1 0.05g，余量为水；

步骤二，将灵芝菌丝体接入种子培养基中，培养，得一级种子培养液；

步骤三，取一级种子培养液，接入种子培养基中，培养，得二级种子培养液；

步骤四，取二级种子培养液，接入发酵培养基中，培养，得发酵细胞；

步骤五，将发酵细胞置于静止培养器皿中，静止培养，加入苯巴比妥或咪康唑，继续静止培养至收获期，收取上层细胞。

步骤二中，所述培养为：25～32℃、80～150rpm下培养3～8天。

步骤三和步骤四中，所述接入具体为：按照体积比，培养液的接入量为培养基的10％。

步骤三和步骤四中，所述培养为：25～32℃、80～150rpm下培养2～5天。

步骤五中，所述加入苯巴比妥具体为：在静止培养的发酵细胞生长中期时，加入苯巴比妥，使得苯巴比妥的终浓度为0.01～1.0mM。

步骤五中，所述加入咪康唑具体为：在静止培养的发酵细胞生长中后期时，加入咪康唑，使得咪康唑的终浓度为0.001～0.1mM。