[发明专利]处理猪角膜以脱细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及处理猪角膜的方法，更具体而言，涉及处理猪角膜以脱细胞的方法。

背景技术

角膜是折射光线的器官，其占眼球最外层膜的六分之一。角膜总共由五个层构成，即，角膜上皮层、鲍曼氏膜(Bowman′s membrane)、角膜基质层(也称作固有质层)、戴氏膜(Descemet′s membrane)和角膜内皮层。角膜上皮由5至6层细胞构成。角膜上皮的基底细胞来自边缘的干细胞，向角膜的中心迁移并在7日内脱落。鲍曼氏膜由非细胞的胶原纤维构成，并且是无色透明的。然而，鲍曼氏膜不能再生，在外科手术或外伤伤害时通常会出现疤痕。角膜基质占角膜厚度的约90％，并具有均匀排列的尺寸一致的细胞。戴氏膜由3至4层细胞构成，并被认为是角膜内皮细胞的基膜。角膜内皮是单层细胞，由特化的内皮细胞构成，在再生方面被严格限制，并且其细胞数量随年龄减少。当细胞数量减少时，细胞尺寸增加以填补空隙。

同时，因角膜透明性丧失而导致的角膜盲是仅次于白内障的引起视力丧失的主要原因。眼外伤和角膜溃疡每年使150万～200万的人们失明。对于这种失明唯一有效的治疗是移植人类供体角膜(也称作“角膜移植术”)。供体角膜的短缺使得需要异体移植的替代方式。

关于角膜置换已经进行了大量研究。合成置换材料包括人工角膜和天然角膜等材料，这些材料使用培养的细胞和细胞外基质(ECM)进行组织工程化。

然而，目前，这些材料因与生物相容性和光学及机械性质有关的问题而没有得到广泛应用，而利用其它动物角膜代替人类角膜的异种移植是发展最快的方法。

猪角膜是最具前景的人类角膜置换物，因为它们具有与人类角膜相当的折射率和尺寸，将猪用于移植被认为是伦理学可接受的，并且基因修饰的猪(例如，α-1，3-半乳糖基转移酶敲除猪和hDAF转基因猪)已被开发并最终进入了临床实践。

然而，传统研究报道了角膜全厚度异种移植会引发严重的免疫排斥。另外，本发明人报道的研究显示，即使在不存在角膜内皮的情况下，板层角膜异种移植也会遭遇免疫排斥[Oh，J.Y.，Kim，M.K.，Wee，W.R.Lamellar corneal pig-to-rabbit xenotransplantation.Xenotransplantation 15，198，2008；Oh，J.Y.，Kim，M.K.，Ko，J.H.，Lee，H.J.，Park，C.G，Kim，S.J.，Wee，W.R.，Lee，J.H.Histological differences in full-thickness versus lamellarcorneal pig-to-rabbit xenotransplantation.Vet Ophthalmol 12，78，2009]。这意味着角膜细胞(角膜基质细胞)也可以引起免疫排斥。

因此，本发明的发明人考虑到，对于具有正常内皮细胞但患有基质浑浊的患者，无细胞的猪角膜基质(已经脱去细胞)可用作板层角膜异种移植的供体组织。此外，角膜移植的新近范式已经由置换整个区域的全厚度角膜移植改变为仅置换病变区域的部分厚度的角膜移植。所述方法被认为在临床实践中更为有用。

有大量无细胞生物材料被用于修复各种器官中的缺陷，并且研究了各种脱细胞方法。

然而，关于对角膜基质脱细胞的方法还没有进行深入研究，特别是关于有效处理角膜同时减小移植后的免疫反应及致病性并保持角膜透明的方法还没有进行研究。

发明内容

因此，鉴于上述问题进行了本发明，本发明的一个目的是提供有效处理角膜同时减小角膜移植术后的免疫反应及致病性并保持角膜透明的方法。

根据本发明，上述和其它目的可以通过提供处理猪角膜的方法而实现，所述方法包括：将摘出的猪角膜浸入NaCl水溶液中；将该猪角膜浸入胰蛋白酶/EDTA水溶液中；和洗涤该猪角膜。

NaCl水溶液和胰蛋白酶/EDTA水溶液的使用能够较少免疫反应和炎症，有助于脱细胞。

NaCl水溶液可以含有1.0M～2.0M NaCl。

将猪角膜浸入NaCl水溶液中的步骤可以在35℃～39℃的温度进行12小时～36小时。

胰蛋白酶/EDTA水溶液可以含有0.01％～0.10％(w/v)的胰蛋白酶和0.01％～0.05％(w/v)的EDTA。

将猪角膜浸入胰蛋白酶/EDTA水溶液中的步骤可以在35℃～39℃的温度进行36小时～60小时。

洗涤可以使用磷酸盐缓冲液(PBS)作为洗涤液来进行。

附图说明