[发明专利]亚硫酸氢化核酸的扩增

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学和表观遗传学领域，涉及核酸的扩增，所述核酸的未甲基化胞嘧啶碱基已经通过亚硫酸氢化反应转变成尿嘧啶碱基。还公开了用于本发明的核酸扩增的反应混合物和试剂盒，以及用于分析核酸甲基化状态的方法。

背景技术

表观遗传机制引起基因表达的改变，所述改变不伴有基因编码序列的变化，但是可以例如通过有丝分裂传递。在高等真核生物中，研究得最好的表观遗传机制除了RNA相关的沉默和组蛋白修饰以外就是DNA甲基化(Serman等，Coll Antropol.2006；30(3)：665-71)。

DNA在核酸的胞嘧啶残基上、优选在具有胞嘧啶-鸟嘌呤序列(CpG)的二核苷酸上被甲基化。在真核生物中，最重要的碱基修饰是胞嘧啶5’位处的甲基化。

然而，甲基化的类型可能是不同的，在植物中除CpG甲基化之外已经公开了CNG和不对称胞嘧啶甲基化，在果蝇(Drosophila)中已经检测到少量CT甲基化。此外，在各种不同的真菌中，已发现非CG甲基化。所述CpG二核苷酸通常聚集在核酸的相对小(500bp-4kb)的区段中，并且如果GC含量＞55％，被称为CpG岛。CpG岛通常被发现在基因调控区附近，并且可能影响所述基因的转录调控。在大多数情况下，CpG岛的甲基化引起受影响基因的失活，因此在许多生物学过程(印迹(imprinting)、X染色体失活、基因表达)中发挥作用，尽管特别是在良性以及恶性肿瘤的发展(Egger等，Nature.2004；429(6990)：457-63)、在某些表型、疾病和细胞衰老中发挥作用。

因此，分析核酸的甲基化在诊断学中是特别重要的(例如用于癌症和其他疾病的早期诊断和分类)，同时出于基因调控的目的对甲基化状态进行靶向修饰，代表了一种可能的治疗策略。因此，检测核酸的甲基化状态非常重要。

核酸的甲基化状态可以通过核酸的亚硫酸氢化作用来分析，所述分析包括将所述核酸的未甲基化胞嘧啶碱基转变成尿嘧啶碱基，同时甲基化的胞嘧啶碱基维持不变。用于分析核酸的甲基化状态的各种不同技术、特别是亚硫酸氢化作用的综述，可以在Fraga等，Biotechniques.2002；33(3)：632，634，636-49和Laird，Nat Rev Cancer.2003；3(4)：253-66中发现。因此，取决于起始核酸的甲基化状态，亚硫酸氢化反应产生具有不同序列的核酸序列，然后在尤其是通过PCR或通过测序分析所述序列后，可以推断起始核酸的甲基化状态。

取决于细胞的发育状态和生理状况，所有胞嘧啶碱基中大约5-15％是甲基化的。因为甲基化的胞嘧啶碱基保持不受亚硫酸氢化反应的影响，这导致起始核酸的所有胞嘧啶碱基中大约85-95％被转变成尿嘧啶碱基。结果，这为起始核酸提供了基本上新的碱基组成，其中胞嘧啶向尿嘧啶的转变从G∶C碱基对产生G∶U错配，因此从那以后，核酸的两条链不再彼此完全互补。产生的错配可以相当多，因为例如含有5％甲基化胞嘧啶的GC含量为50％的DNA，在亚硫酸氢化作用后可能只具有28％的GC含量。

亚硫酸氢化反应后得到的具有改变的碱基组成的该被转变的核酸的扩增，特别是在PCR扩增的情况下，可能引起极大困难。因此，对于通过亚硫酸氢化作用转变的核酸的改进的扩增，存在着需求。本发明为该问题提供了解决方案。

发明简内容

本发明涉及用于扩增通过亚硫酸氢化转变的核酸的改进的反应混合物和方法，用于分析核酸甲基化状态的方法，以及相应的试剂盒。本发明是基于令人吃惊的发现，即利用亚硫酸氢化反应进行了转变的核酸的扩增，可以通过将反应混合物中核苷酸dATP和dTTP的浓度增加到超过dCTP和dGTP的浓度，来显著改进。

本发明的一个方面涉及用于核酸扩增的反应混合物，所述反应混合物包含dATP、dTTP、dCTP和dGTP，以及包含尿嘧啶的核酸，其特征在于dATP和dTTP的起始浓度高于dCTP和dGTP的起始浓度。

特别优选情况下，使用的核苷酸不带标签或不被标记，即尤其是不具有任何荧光、发光或重量标志物、含有染料的或染色标志物(特别是酶标志物)、磁性、放射活性、可放射性检测或免疫标志物、抗原、凝集素或其他可检测标志物或标记物。

在优选实施方案中，反应混合物中dATP和dTTP的起始浓度为dCTP和dGTP起始浓度的200％到600％。在更优选实施方案中，反应混合物中dATP和dTTP的起始浓度为dCTP和dGTP起始浓度的300％到500％。

本发明的第二方面涉及用于扩增通过亚硫酸氢化反应转变的核酸的方法，所述方法包括下列步骤：