[发明专利]具有对人C-MET受体酪氨酸激酶的亲和性的泪脂质运载蛋白的突变蛋白及其获得方法

说明书

本申请要求2008年1月30日提交的美国临时申请第61/024,658号的优先权权益，其内容为所有目的通过引用整体并入本文。

本发明涉及具有对人Met受体酪氨酸激酶(c-Met)或其结构域或片段的可检测的结合亲和性的人泪脂质运载蛋白(hTLc)的突变蛋白。此类突变蛋白包含相应于hTLC的序列位置26-34、56-58、80、83、104-106和108的序列位置中的至少一个的氨基酸置换。本发明还涉及编码此类突变蛋白的相应核酸分子和它们的产生方法。本发明进一步涉及产生此类突变蛋白的方法。最后，本发明涉及包含此类脂质运载蛋白突变蛋白的药物组合物以及所述突变蛋白的各种用途。

Met受体酪氨酸激酶(RTK)最初被鉴定为人原癌基因Tpr-Met的产物(Park等人，Proc.Natl.Acad.Sci，USA，Vol.84，第6379-6383页，1987)。c-Met的配体被鉴定为是肝细胞生长因子(HGF)。HGF初始地被鉴定为培养的肝细胞的丝裂原。HGF与散射因子(SF)相同，散射因子是促进上皮细胞片层分散、以及三维培养物中生长的上皮的分支小管发生(tubulogenesis)的成纤维细胞衍生因子。因此，HGF/SF是引发包括有丝分裂、细胞运动性和形态发生的多种细胞应答的独特生长因子。

HGF/SF和c-Met在成年人的许多组织中表达。c-Met蛋白最主要地在上皮细胞中表达，但也在内皮细胞、神经细胞、肝细胞、造血细胞、黑素细胞中表达。c-Met很可能是最重要的膜受体之一。其活化在细胞生理学中起关键作用：有丝分裂发生、运动发生(motogenesis)、形态发生。HGF/SF看起来基本上是由间质起源的细胞产生的。

当HGF/SF活化c-Met时，下游被活化的第一种蛋白是Grb2(生长因子受体结合蛋白2)和Gab 1(生长因子受体结合蛋白2相关结合蛋白1)。Grb2又可能活化许多激酶途径，包括从Ras到Raf到Mek和到MAPK(丝裂原活化的蛋白激酶)的途径。Gab 1活化PI3K(磷酸肌醇3激酶)，PI3K活化STAT3(信号传导子及转录激活子)。c-Met活化还诱导β连环蛋白的活化，β连环蛋白是wnt途径的关键组分，其易位至核中并参与转录调节。

HGF/c-Met途径在癌症发展中起重要作用。第一通过关键致癌途径的活化(Ras、PI3K/STAT3、β连环蛋白)，第二通过内皮细胞增殖(新血管发生(neoangiogenesis))，第三通过增加的蛋白酶产生以及由此的导致转移的细胞解离。

许多新的治疗方法是针对HGF/c-Met途径，其中一些处于I或II期临床试验。这些方法包括抗HGF单克隆抗体，诸如AVEO的人源化形式AV299或来自Amgen的命名为AMB 102的完全人抗体(AMG102)。另一种方法是使用充当诱饵的c-Met的截短的变体。一个此类实例是来自COMPUGEN的称为CGEN241的截短形式。另外，阻断c-Met诱导的途径的蛋白激酶抑制剂(小分子)被用于治疗目的。此类小分子蛋白激酶抑制剂的实例包括来自ARQULE的ARQ197、来自EXELIXIS的XL880、来自SGX Pharmaceuticals的SGX523、来自SUPERGEN的MP470、或来自PFIZER的PF2341066。

尽管如此，仍期望有结合c-Met并可例如用于治疗目的的其他可用的化合物。

因此，本发明的目标是提供具有对给定靶标的高结合亲和性的人泪脂质运载蛋白突变蛋白。

这一目标通过例如具有对人Met受体酪氨酸激酶(c-Met)或其结构域或片段的可检测的结合亲和性的人泪脂质运载蛋白(hTlc)突变蛋白实现，其中此类突变蛋白包含相应于hTLC的序列位置26-34、56-58、80、83、104-106和108的序列位置中的至少一个的氨基酸置换。

在相关的方面，本发明提供产生人泪脂质运载蛋白的突变蛋白的方法，其中所述突变蛋白以可检测的结合亲和性结合c-Met。这一方法包括：

(a)使编码人泪脂质运载蛋白的核酸分子经受在天然的成熟的人泪脂质运载蛋白的线性多肽序列的氨基酸序列位置26-34、56-58、80、83、104-106和108中的任何氨基酸序列位置的至少一个密码子处的诱变，其中编码成熟的人泪脂质运载蛋白的线性多肽序列的序列位置61和153处的半胱氨酸残基的密码子中的至少一个已被突变为编码任何其他氨基酸残基，从而获得编码人泪脂质运载蛋白的突变蛋白的多种核酸，