[发明专利]细胞培养方法及筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞培养方法及筛选方法。

背景技术

将从组织中分离的细胞用于试验、检查的技术是在生物技术相关领域不可或缺的方法。广泛应用于疾病、病状的诊断，新药的开发及药效的判定，或是动物检查、植物检查、环境污染物质的试验等。因此，生物技术区域中使用的细胞种类极其多样化。

分离的细胞有直接以悬浮状态应用于试验的情况，但多数情况下，在使细胞附着于培养皿的状态下进行培养而用于各种试验、检查中。细胞培养中使用的原代细胞、细胞系，要求能够和在生物体内进行的试验即所谓的体内试验显示出相同的药物敏感性、毒性反应等。即，在细胞培养容器上必须具有和在生物体内类似的细胞机能。此外，因为得到原代细胞的分离操作繁杂，细胞培养试验中使用的细胞培养株价格昂贵，故期望用少数细胞即可进行的试验方法。

近年来，新药开发中出现了在临床试验阶段的开发中断的问题。这是因为药物代谢试验阶段中动物种群差异的结果。到目前为止，临床前阶段中进行的药物代谢试验使用大鼠、狗、猴等动物，来预测药物的体内代谢。但是，在对人进行的临床试验中，其预测在事实上并不成立。因此，在进行对人的药物代谢等的预测上，使用人试验材料是最有效且简便的方法，以其高效的医药品开发和安全的临床试验的实施而重要。

考察药物在体内的代谢的药物代谢试验，主要在肝脏内进行吸收、代谢和排泄，使用的人试验材料包括肝脏切片、肝细胞、肝微粒体等。其中肝脏切片获取困难，肝微粒体仅能在限定了代谢酶的代谢试验中使用。因此，使用肝细胞是最有效的。

在筛选中，使用的培养皿为树脂制皿和6孔、12孔、48孔、96孔的各种培养板。其中，一般情况下，全部培养板的大小基本相同，孔数越多，1孔的大小就越小。此1孔相当于1个培养皿。此外，因为最近有向微量化发展的趋势，故更小孔径的多个培养皿组成的384孔培养板也开始使用，使用与作为目的的筛选方法相适应的培养板。这些培养皿的底部为平坦的平板状，将此底面作为培养面来使用。

但是，若在组织细胞的培养中使用现有的培养容器，会出现使其原来的机能消失而去分化的情况、未分化细胞不分化的情况，产生不能发挥目的细胞的机能的问题。例如，人新鲜肝细胞在通常的平板培养板上培养和分离时的代谢酶的机能在1日范围内会显著下降，故向培养板上接种细胞后在4小时内应进行药物代谢试验。即，存在进行长时间的培养时不能用于试验的问题，以及不能研究长时间的代谢稳定性的问题。

为解决上述问题，进行了将人或动物来源的生物体物质(糖蛋白质、蛋白质等)对培养容器表面进行包覆的尝试(参考专利文献1)、在高分子凝胶中培养的尝试(参考专利文献2)和在微量容器中形成肝细胞块的尝试(参考专利文献3)。

专利文献1：日本特开平第8-319317号公报

专利文献2：日本特开平第8-308562号公报

专利文献3：国际公开第2008/130025号

发明内容

发明所要解决的课题

但是，在专利文献1公开的方法中，会出现因包覆的生物体物质特殊而导致的高成本，培养容器内均一的细胞集合体的形成困难，不能长时间维持生物体内机能等的问题。专利文献2公开的方法中，会出现不能控制细胞集合体的大小、难于进行显微镜观察、作为筛选基板的操作性繁杂等问题。此外，上述的两种方法，均将市售的培养皿和培养板作为支撑容器来使用，故难于在必要最小细胞数下进行有效的筛选。专利文献3公开的方法中，培养初期的肝细胞代谢活性有升高的可能，但在2周以上难于维持代谢活性。

本发明的目的在于提供可以长时间维持生物体内机能且可以以必要最小细胞数来培养的细胞培养方法。

解决课题的手段

本发明的细胞培养方法，是通过在经分隔的微小空间内，以多层化的状态培养未分化细胞，得到分化细胞的方法。其中，所谓多层化是指产生2层以上的细胞层积。在对医药品进行筛选的情况下，优选向肝细胞、肠上皮细胞、神经细胞、心肌细胞、血管内皮细胞分化的未分化细胞。尤其是在进行对人的药物代谢等预测的情况下，未分化细胞优选人细胞。前述未分化细胞优选肝细胞、前体细胞等。