[发明专利]具有提高的L-苏氨酸生产率的大肠杆菌菌株和利用其生产L-苏氨酸的方法

说明书

相关专利申请的交叉参考

本申请要求于2008年1月8日提交至韩国知识产权局的韩国专利申请号10-2008-0002310的利益，其公开内容通过引用完全结合在本文中。

发明背景

1.发明领域

本发明的一个或多个实施方案涉及具有提高的L-苏氨酸生产率的生产L-苏氨酸的大肠杆菌(Escherichia coli)(E.coli)菌株，和利用其生产L-苏氨酸的方法，在所述生产L-苏氨酸的大肠杆菌中，染色体上的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)基因的启动子被替换为半胱氨酸合酶(cysK)基因的启动子。

2.相关领域描述

L-苏氨酸是一种必需氨基酸，而且广泛用作动物饲料添加剂或食品添加剂，还用作医药流体或药物合成的原料。尽管动物蛋白包含足够量的L-苏氨酸，但是植物蛋白缺乏L-苏氨酸。因此，在主要为食草性饲料的动物中可能缺乏L-苏氨酸，并且因此L-苏氨酸特别地广泛用作动物饲料的添加剂。

L-苏氨酸主要利用通过人工诱变或遗传重组开发的大肠杆菌(E.coli)或棒杆菌(Corynebacterium)通过发酵方法生产。为了生产L-苏氨酸，使用来源于大肠杆菌(E.coli)野生型菌株、棒杆菌属(Corynebacteria sp.)、沙雷氏菌属(Seratia sp.)、或普罗威登斯菌属(Providencia sp.)的突变菌株。突变菌株的实例包括氨基酸类似物-抗性或药物-抗性突变菌株，和二氨基庚二酸(diaminopimellic acid)、甲硫氨酸、赖氨酸、或异亮氨酸营养缺陷型突变菌株，其也具有氨基酸类似物-抗性或药物-抗性。在利用突变菌株生产L-苏氨酸的方法中，日本专利号10037/81公开了利用属于大肠杆菌物种、具有二氨基庚二酸和甲硫氨酸营养缺陷型表型、且突变以使L-苏氨酸的生物合成不受苏氨酸的反馈抑制影响的微生物的方法。

使用重组菌株的发酵方法也可以用于生产L-苏氨酸。例如，日本专利申请公开号05-227977公开了一种利用以质粒形式向其中引入由编码天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶、和苏氨酸合酶的基因组成的苏氨酸操纵子的重组大肠杆菌生产L-苏氨酸的方法，和利用其中引入来源于大肠杆菌的苏氨酸操纵子的生产苏氨酸的黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)生产L-苏氨酸的方法(TURBA E，等，Agric.Biol.Chem.(农业生物化学)53：2269～2271，1989)。

通常，特定基因在微生物中的表达可以通过增加该基因在该微生物中的拷贝数而提高。为此，使用为微生物提供更多拷贝数的质粒[Sambrook等，Molecular Cloning(分子克隆)，2th，1989，1.3-1.5]。即，通过将靶基因插入到其拷贝数保持在高水平的质粒中和然后用所获得的重组质粒转化微生物，可以将基因数目增加到与每单一微生物中的质粒的拷贝数一样多。利用该方法也已经进行了提高苏氨酸生产率的尝试，并且报道了部分成功(美国专利号5,538,873)。然而，这种利用质粒的技术在大多数情形中仅诱导特定基因的过量表达，由此对宿主微生物产生很重的负担。此外，在重组菌株的培养过程中，质粒可能丢失，由此降低质粒的稳定性。为了解决利用其中引入质粒的重组菌株生产苏氨酸的方法的这些问题，已经开发了向培养物中添加抗生素和利用表达可控的质粒的方法[Sambrook等.Molecular Cloning(分子克隆)，2th，1989，1.5-1.6，1.9-1.11]。在利用表达可控的质粒的情形中，为了在生长阶段过程中减轻对宿主微生物的负担并且获得大量的细胞，在不发生质粒上靶基因表达的条件下培养宿主微生物，并且在宿主微生物充分生长后，诱导基因的暂时性表达，由此获得靶物质。然而，利用表达可控的质粒的方法仅在终基因产物为蛋白或次级代谢物时可以使用。在基因产物为在微生物开始生长时同时产生的主要代谢物的情形中，必须在生长阶段过程中诱导靶基因表达。否则，很难预见主要代谢物的累积。由于苏氨酸属于主要代谢物，后一种情形也适用于苏氨酸。

因此，为了提高作为主要代谢物的苏氨酸的生产率，美国专利号5,939,307中公开了将参与苏氨酸生物合成的基因插入到微生物的染色体DNA中，而不使用将具有苏氨酸生物合成相关的基因的质粒引入到微生物中的方法。已经广泛开发了增加苏氨酸生物合成相关的基因及其表达的方法，但是仍然存在对开发以高产率更经济地生产L-苏氨酸的方法的需要。