[发明专利]蛋白表达系统

说明书

发明领域

本发明一般性地涉及用于提高基因，例如编码目的蛋白质的异源基因，在植物和其它真核生物细胞内表达的方法和材料，特别是源自病毒的序列。

发明背景

豇豆花叶病毒属病毒(comoviruses，CPMV)

豇豆花叶病毒属是具有二分体(bipartite)基因组的RNA病毒。豇豆花叶病毒RNA基因组的节段称作RNA-1和RNA-2。RNA-1编码VPg、复制酶和蛋白酶蛋白(Lomonossoff&Shanks，1983)。复制酶是病毒复制病毒基因组需要的。豇豆花叶病毒属的豇豆花叶病毒(CPMV)的RNA-2编码一个58K和一个48K的蛋白质，以及两个病毒衣壳蛋白L和S。

所有豇豆花叶病毒RNA-2的翻译起始于两个不同的起始位点，它们位于相同的三联阅读框内，最终合成两种共羧基端蛋白质(carboxy coterminalproteins)。这种双起始现象的发生是翻译期间核糖体“遗漏扫描(leakyscanning)”的结果。

CPMV RNA-2的5’端起始密码子(AUG)出现在位置115、161、512和524。位置161和512位的起始密码子处于相同的三联阅读框内。从161位的起始密码子起始则合成一个105K的多聚蛋白(polyprotein)，而从512位的起始密码子起始则合成一个95K的多聚蛋白。因为这两种多蛋白质的合成在3299位的相同终止密码子处终止，所以105K和95K蛋白质是共羧基端的。如果512位的AUG被删除，那么524位的AUG密码子可以作为起始子。然而，在AUG 512存在时，它不发挥这一功能，而只是编码氨基酸甲硫氨酸(Holness et al.，1989；Wellink et al.，1993)。115位的起始密码子不是病毒复制必需的(Wellink et al.，1993)。

由CPMV RNA-2基因组节段编码的105K和95K蛋白质是主要的翻译产物，它们随后被RNA-1编码的蛋白水解活性切割，产生所述的58K或48K蛋白质(这取决于所处理的是105K还是95K蛋白质)和两个病毒衣壳蛋白，L和S。在CPMV的512位的起始密码子处起始翻译比在161位更加高效，从而产生比105K多蛋白质更多的95K多蛋白质。

CPMV RNA-2的115位的起始密码子位于161位和512位起始位置的上游，并处于另一阅读框内。因为该起始密码子与位置175处的种子密码子同相(in-phase)，所以在该位点起始应可产生一条20个氨基酸的肽。然而，迄今尚未发现这种肽的产生。

保持不同AUG之间合框的必要性

突变实验已经显示，保持CPMV RNA-2位置161和512处的起始位点之间合框对于由RNA-1编码的复制酶高效复制RNA-2是至关重要的(Holness et al.，1989；van Bokhoven et al.，1993；Rohll et al.，1993；Wellink etal.，1993)。在基于CPMV RNA-2的表达载体(见下文)中，这种要求限制了512位起始密码子上游可插入的序列的长度，使得将外来基因克隆进入这种载体比理想情况下更难。例如无法使用多接头(polylinker)，因为使用多接头往往会改变这些起始位点之间的开放阅读框(ORF)。

CPMV载体

人们已经使用CPMV作为开发适合于在植物内产生异源多肽的载体系统的基础(Liu et al.，2005；Sainsbury et al.，2007)。这些系统是基于RNA-2的修饰，但是在使用全长型RNA-2还是缺失型的RNA-2上有所不同。然而在两种情况下，都可通过与RNA-1共温育(co-inoculation)实现经修饰的RNA-2的复制。基于全长型RNA-2的表达系统包括将外来蛋白质融合到RNA-2来源多蛋白质的C端。N端多蛋白质的释放由来自口蹄疫病毒2A催化肽序列的作用介导(Gopinath et al.，2000)。最终的RNA-2分子能够在植物内部和植物之间传播。这种策略已经被用于在豇豆植物体内表达许多种重组蛋白质，例如乙型肝炎核心抗原(HBcAg)和小免疫蛋白(Small Immune Protein)(SIPs)。(Mechtcheriakova et al.，2006；Monger et al.，2006；Alamillo et al.，2006)。尽管全长病毒载体的利用取得了成功，但是在插入序列大小的限制，以及对生物防护的关切方面尚有不足。